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1、蔬菜、水果中吡蚜酮胶体金快速检测方法的建立作者1作者2（l.xxxxxxxxxxxxxxx有限公司， xx xxxxxx ）（2.XXXXXXXXXXXXX 技术有限公司，xx xxxxxx ）摘要：通过胶体金、单克隆抗体 -胶体金标记物、结合物释放垫、反应膜的制备以及试纸条的组装建立了 快速检测蔬菜、水果中吡蚜酮的胶体金免疫层析分析方法。结果表明，胶体金试纸条对蔬菜、水果中吡蚜 酮的检测限为0.2ug/mL，假阳性率不超过5%，假阴性率为0,检测时间短、特异性高、稳定性好、与气相 色谱检出符合率为97.5%。关键词：胶体金免疫层析法； 蔬菜、水果；快速检测；吡蚜酮Establishment
2、of a Detection Method for the ImmuneColloidal Gold of pymetrozine in Vegetables and fruitsAuthor1, Author2（1. xxxxxxxxxxxxxxx 有限公司，xx xxxxxx）（2.XXXXXXXXXXXXXXX 有限公司， XX xxxxxx）Abstract: A colloidal gold immunochromatographic strip for rapid detection of pymetrozine in Vegetables and fruits was prese
3、nted by the parts of strip prepared and assembled, prepared of colloidal, monoclonal antibody colloidal gold marker and conjugate release pad. The results demonstrated that the limit of detection （LOD） of the pymetrozine was 0.2ug/mL . False positive rate and false negative rate were 5% and 0. The d
4、etection time is short, the specificity is good, and the detection coincidence rate with the gas chromatographic was97.5%.Key words: gold immunochromatography assay; tobacco leaf; rapid detection; carbendazim吡蚜酮属于吡啶类或三嗪酮类杀虫剂，是全新的非杀生性杀虫剂，最早由瑞士汽巴嘉基公司于1988年开发，该产品对多种作物的刺吸式口器害虫表现出优异的防治效果。吡蚜酮 对害虫具有触杀作用，同时
5、还有内吸活性。在植物体内既能在木质部输导也能在韧皮部输导； 因此既可用作叶面喷雾，也可用于土壤处理。由于其良好的输导特性，在茎叶喷雾后新长出 的枝叶也可以得到有效保护。利用电穿透图（EPG）技术进行研究表明，无论是点滴、饲喂或注射试验，只要蚜虫或 飞虱一接触到吡蚜酮几乎立即产生口针阻塞效应，立刻停止取食，并最终饥饿致死， 而且此过程是不可逆转的。因此，吡蚜酮具有优异的阻断昆虫传毒功能。尽管目前对吡蚜酮所引起的口针阻塞机制尚不清楚，但已有的研究表明这种不可逆的”停食不是由于拒食作用”所引起。经吡蚜酮处理后的昆虫最初死亡率是很低的，昆虫”饥蛾”致死前仍可存活数日，且死亡率高低与气候条件有关。试验表
6、明，药剂处理3小时内，蚜虫的取食活动降低90%左右，处理后48小时，死亡率可接近 100%。1. 材料与方法1.1材料和仪器作者简介：姓名（岀生年一），性别，学历，职称，研究方向 基金项目：蔬菜、水果，来自市场；吡蚜酮、氯化锡、牛血清白蛋白（BSA ），美国Sigma公司；氯金酸、柠檬酸三钠，三氟乙酸，三氟乙酸酐，硝酸铵，二氯甲烷，乙醚，国药集团化学试 剂有限公司；PVC背板，上海金标生物科技有限公司；硝酸纤维素膜、吸水垫、样品吸收 垫，普利来基因技术公司；碳酸钾、乙醇、甲醇（分析纯），北京化学试剂公司；磷酸盐缓 冲液（简称 PBS）0.2 mol/L、pH7.2 ;金标抗体稀释液含 BSA0
7、.2%0.5%、蔗糖1%2% （质 量分数）、pH7.2的0.02 mol/L磷酸盐缓冲液；双蒸水。8010S匀浆机（上海斯伯明仪器设备有限公司）；KS- H振荡器（上海跃进医疗器械厂）；QL-901漩涡混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；2000SBL电子天平（美国Setra公司）；CT300数控切条机（上海金标生物科技有限公司）；Isoflow喷膜仪（ImageneTechnology INC. ） ； 752S分光光度计（上海棱光技术有限公司）；DHP-600生化培养箱（天 津市中环实验电炉有限公司）；Milli-Q Referenee纯水仪（美国 Millipore ） ； 90
8、-2磁力搅拌器（上海振荣科学仪器有限公司）；微量移液器（单道 20200 L 1001000 uL （美国 Thermo公司）；Anke GL-20G- n高速离心机（上海安亭科学仪器有限公司）。1.2方法1.2.1吡蚜酮半抗原的制备将20 mL三氟乙酸和2 mL三氟乙酸酐在 0 C条件下加入 0.5 g硝酸铵搅拌1 h,向其中 加入含1.0 g吡蚜酮的三氟乙酸溶液，搅拌反应2 h。反应结束后用氢氧化钠溶液将其调节为中性，经过二氯甲烷和乙醚提纯后得到结晶产物。将结晶产物溶解于乙醇，加入氯化锡水溶液，氮气保护下加热回流反应3 h。反应结束后旋转蒸发除去乙醇，通过萃取洗脱分离即得吡蚜酮半抗原，其合
9、成路线如图1所示。图吡蚜酮半抗原合成路线Fig.1 Synthetic route of the carbendazim haptens1.2.2吡蚜酮单克隆抗体的制备将吡蚜酮半抗原与卵清蛋白（ovalbumin , OVA）和牛血清蛋白（bovine serum albumin ,BSA ）偶联制备成包被原和免疫原，用免疫原免疫小鼠， 将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞通过融合、筛选得到吡蚜酮单克隆杂交细胞株。1.2.3胶体金的制备用双蒸去离子水将质量分数为1%氯金酸稀释成 0.01%，置于磁力加热搅拌器上搅拌煮沸，每100 mL 0.01%氯金酸加入2.5 mL 1%柠檬酸三钠，继续搅拌加热反应至液
10、体呈红色时停止加热，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4C保存备用。1.2.4吡蚜酮单克隆抗体-胶体金标记物的制备在磁力搅拌下，用 0.25 mol/L碳酸钾调节胶体金的 pH至7.0，按每毫升胶体金溶液中 加入2050 yg的标准向胶体金溶液中加入吡蚜酮单克隆抗体，继续搅拌30 min，加入10%BSA使其在胶体金溶液中的终浓度为1% （体积分数），静置 10min。 12000 r/min、4 C条件下离心40min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的金标抗体稀释液将沉淀重悬，置4 C备用。1.2.5结合物释放垫的制备将结合物释放垫浸泡于含有牛血清白蛋白
11、（牛血清白蛋白在缓冲液中的浓度为 0.5%）、pH为7.2、0.5 mol/L的磷酸盐缓冲液中，均匀浸湿 1 h, 37 C烘干3 h备用。用Isoflow喷 膜仪将制备好的吡蚜酮单克隆抗体-胶体金标记物均匀喷涂在结合物释放垫上，每1 cm结合物释放垫喷涂0.01 mL吡蚜酮单克隆抗体-胶体金标记物后，置于37 C环境中（湿度20%） 60 min后取出，置于干燥环境（湿度 20%）中保存备用。1.2.6反应膜的制备将吡蚜酮半抗原-卵清蛋白偶联物包被到反应膜上构成检测线，将羊抗鼠抗体包被到反 应膜上构成质控线。1.2.8胶体金试纸条的组装人工将样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜依次按顺序黏贴在
12、底板上，用数控切条机切割成4mm宽的试纸条，放入干燥剂备用，如图 2所示。T线（检测线）图2胶体金试纸条结构图Fig.2 The structure chart of the test strip1.2.9样本前处理方法蔬菜、水果样本前处理方法：检测前将样本粉碎，称取1.0 .05 g粉碎的样本至样本提取液中至液面全部浸满，振荡1 min，静置后移取0.15 ml上清液加入到样本稀释液中混匀。1.2.10吡蚜酮试纸条性能的测定实验测定吡蚜酮试纸条检测限、特异性、假阳性率、假阴性率、稳定性以及符合性等。试纸条检测限的测定在空白蔬菜、水果样本中分别添加吡蚜酮标准品至一定浓度，取三批试纸条进行测试，
13、每个浓度重复测定5次，以验证本试纸条的检测限。假阳性率、假阴性率测定 取阴性蔬菜、水果样本各50份，用三批试纸条检测计算出假 阳性率。取添加吡蚜酮浓度为0.2ug/mL的阳性蔬菜、水果用三批试纸条检测计算出假阴性率。特异性试验特异性是指抗体与结构不同的抗原决定簇发生结合的能力。分别向蔬菜、水果中添加一定浓度的蔬菜、水果中常检的其他药物（三唑酮、甲霜灵、吡虫啉、三唑酮） 用试纸条进行检测，判断其特异性。稳定性测定 将吡蚜酮快速检测试纸条在430C中保存，检测10个阴性蔬菜、水果样本，10个吡蚜酮添加浓度分别为 0.2ug/mL的阳性蔬菜、水果。符合性实验各取20份蔬菜、水果盲样，分别用胶体金免疫
14、层析法和GC法测定其中吡蚜酮残留量。当样品中吡蚜酮含量低于胶体金试纸条检测限浓度，判为阴性，试纸条阴性结果用“-”表示，GC法阴性结果用“-”表示；当样品中吡蚜酮含量高于胶体金试纸条检测 限浓度，判为阳性，试纸条阳性结果用“+ ”表示，GC法阳性结果用实测值表示。2. 结果与讨论2.1试纸条检测限测定结果及分析在空白蔬菜、水果中分别添加吡蚜酮浓度为0.25、0.5、1.0、2.0、3.0卩gmL ;用吡蚜酮胶体金试纸条进行检测，每个添加浓度重复测定3次，观察试纸，判断结果，确定检测限。以只出现C线时的最低标准品浓度作为试纸条的检测限，试验结果见表1。表1试纸条检测限测定结果Table1 The
15、 limit of detection results of the rapid detection strip样本添加浓度卩 g/mL）检测结果（n=3）样本添加浓度（卩 g/mL）检测结果（n=3）0.25一0.25一0.5一0.5一蔬菜、水果1.0一蔬菜、水果1.0+2.0+2.0+3.0+3.0+注：阴性（一）:C线和T线都显色；阳性（ + ）:C线显色，T线不显色。由上述测定结果可知，自主研发的吡蚜酮胶体金试纸条对蔬菜、水果吡蚜酮的检测限为0.2ug/mL。2.2试纸条特异性结果及分析分别向空白蔬菜、水果样本中添加其他药物（甲霜灵、吡虫啉、三唑酮、三唑醇）至浓度为 0 冯/mL、1（_g/mL、2 冯/mL、10 用/mL、20 用/mL、50（_g/mL、100（_g/mL。用试纸条 进行检验，不同药物每个浓度重复三次，根据试验结果判定试纸条的特异性。表2三唑酮快速检测试纸条特异性检测结果吡蚜酮+蔬菜、水甲霜灵
