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1、精液冷冻保存是将精液进行特殊处理，保存在超低温下，以达到长期保存的目的。 通常采用液氮（一19 6 ）和干冰（一7 9 ）保存。其最大优点是可长期保存，使 用不受时间、地域以及种用雄性动物寿命的限制。可充分提高公牛的利用率。现将冷冻 精液保存起来和怎样进行解冻及给母牛输精的有关技术操作介绍如下，供参考。一、稀释液的配方：12%的蔗糖液7 5毫升、甘油5毫升、卵黄液2 0毫升。二、稀释方法：将经过检查合格的精液（活力0•6以上、精子密度中等）按1：25倍稀释液进行稀释，其稀释原则应保证每个颗粒精液中所含精子数不少于3 0 0 0 4 0 00万个，解冻后呈直线前进运行的精子不少于15
2、00万个。三、冷冻：在装有液氮的容器上置一铜纱网，距液氮面2厘米左右，使温度维持在一8 0C至 10 0C。将平衡后的精液用滴管按一定量（0& #8226; 1毫升）滴于铜纱网、滴完 最后一滴停3 5分钟后，当精液颗粒颜色变白时，立即浸入液氮，并将全部颗粒取下， 收集于贮精瓶或纱网布袋内，并做好标记，然后立即移入液氮罐中贮存。四、解冻：将预先配制好的2•9%柠檬酸的溶液1毫升，放入干净的小试管中，再置于4 0C左右的温水杯中，迅速取颗粒冷冻精液1粒放入试管。轻轻摇动至化冻时，从水 杯中取出试管，接着检查精液活力，不低于0•3即为合格品。五、重视保精、快速解冻与镜检1、根
3、据液氮罐的性能要求，定期添加液氮罐内盛装冻精的提筒不能露在液氮面外。2、取精时，尽可能用长镊子，切勿将提筒或纱布袋提到临界线以上处（罐顶10厘米 左右）。3、从液氮中取出细管冻精时，要轻轻甩12下，将塑料细管的棉塞端放入354 0C的温水中，把封口端留在水外1 一 1 • 3厘米外，待管内精液融化一半时， 立即取出备用。4、解冻后的精液镜检时，精子的活力不低于0 •3方可用于输精，才能确保正 常受精。5、解冻后的精液应立即输配，不宜停放时间过长，应做到现解冻、现输精。六、适时输精母牛正常排卵是在发情结束后6 一12小时，精子在母牛生殖道的存活时间为1 2 一20小时，且
4、还需要4一6小时的获能过程，才能与卵子结合受精。精子15分钟 就会到达输卵管受精部位，因此，让精子早于卵子到达输卵管受精部位是提高受胎率的 先决条件。1、适宜的输精时间：是在母牛的发情后期。此时母牛表现：精神平稳，外阴部肿胀消 失，阴道不再流出透明液体。直肠检查卵泡胀大，表面紧张，有一触即破之感。此时为 最佳输精时机。2、适宜的输精部位：是在子宫颈内口1厘米处即子宫体基部，过浅易导致精液外流， 过深易损伤子宫内粘膜。3、适宜的输精方法：直肠把握子宫颈输精法。将母牛保定，左手插入母牛直肠轻轻握 住子宫颈后端，右手将输精器自阴门向斜上方缓慢插入5一10厘米（以避开尿道口） 再改为平插送到子宫颈口，
5、缓慢越过子宫颈管中的皱壁，到达子宫颈基部，徐徐注入精 液后，缓缓抽出输精器。4、适宜的输精次数：以1一2次为宜。可在发情母牛发情高潮后，黄牛在发情高潮后6 12小时，水牛在发情咼潮后182 0小时进彳丁第一次输精，前后间隔812 小时再进行第二次输精。B1 抽样B1.1 样品的收集抽样：从受检单位精液库中抽取样品。送样：将样品送至检验机构。B1.2 抽样方法B1.2.1 正常检查一次抽样方案各品种投产公牛按牛号顺序排列，由抽样人员现场随机确定取样牛号。各品种公牛抽样头数，按照GB2828 87中条有关标准的规定。全部取样对已投产的公牛每头取样。样品的抽取凡确定取样的公牛，从其精液贮藏罐中随机抽
6、取一个包装量的精液（不得少于Zo份）。样品的保存存放冷冻精液的低温容器质量应符合GB5458规定，使用前经过清洗后加入新鲜液 氮。取放样品时空中暴露时间不得超过5秒。由专人保管样品，不能脱离液氮，抽样报告单随样品行。B1.2.4.4 样品包装、标记应保持原样。B2 剂量检查主要器材 天平（精度木低于干分之一）、小烧杯、剪刀。B2.1细管取三支细管冻精，解冻后剪去超声波封口端，把精液挤入小烧杯内（小烧杯的重量应事 先称取或事先去掉烧杯重），用天平准确称取精液的重量（W）,精液的比重（D=1.04）。 每支细管冻精的剂量=W / 3D。B2.2颗粒取三粒颗粒冻精，直接放入小烧杯内用天平准确称取精液
7、的重量（W）,每颗颗粒冻精 的剂量=W/3D。B3 精子活力的检查主要仪器和器材显微镜或显微电视装置、恒温水浴箱、5.0mL试管、载玻片或精液性状 板、盖玻片（18X1 8）、显微镜保温箱或恒温装置、滴管、2.9%柠檬酸钠溶液。B3.1解冻细管直接置于37C水浴中解冻；颗粒冻精置预先预热至38C的内有1.0mL柠檬酸钠解 冻液的试管中，水浴解冻，适当摇动，使冻精融化。B3.2检查取解冻后精液50UL （微升）置于载玻片上加盖被片立即在200-400倍显微镜下观察活 力，环境温度或载物台温度保持38C ；也可通过电视显微装置在荧光屏上观察活力。每样 品观察3个视野，注意不同液层内的精子运动状态，
8、进行全面评定。B4 每一剂量呈直线前进运动的精子数主要器材血球计数板、血色素管、lmL吸管、小试管、计数器、显微镜或电视显微装 置、滴管、3.0%氯化钠溶液。B4.1检查方法颗粒冻精用血色素管准确吸取10微升干解冻的精液，注入盛有0.99mL的3.0%氯化钠 溶液的试管内，混匀，使之成为100倍稀释的稀释精液；细管精液用血色素管准确吸取20 微升干解冻精液，注入盛有0.98mL的3.0%氯化钠溶液的试管内，混匀，使之成为50倍稀 释的稀释精液。将备好的血球计数板用血盖片将计数室盖好，用小吸管吸取一滴稀释精液于 血盖片边缘，使精液自行流入计数室，均匀充满不能有气泡或厚度过大，然后在显微镜下或 电
9、视荧光屏上观察计数。B4. 2计算公式a. 每剂量中精子数=5个中方格中的精子数（即计数室个中方格的总精子数）X10（l立方 毫米内的精子数）X1000 （每毫升精液的精子数）X100 （颗粒稀释倍数）或50 （细管稀释 倍数）X剂量值。上式可简化为每剂量中精子数=5个中方格精子数X500万（颗粒）或250万（细管）X剂量值b每样品观察上下两个计数室，取平均值，如二个计数室计数结果误差超过5%，则应重 检。c.每剂量中呈直线前进运动精子数=每剂量中精子数X活力（）B5 精子存活率的检查主要器材 显微镜、恒温箱、吸管、载玻片、盖玻片。B5.1解冻方法按照B2.1，精子活力的检查按照B2.2。B5
10、.2存活率的评定冻精解冻后置37C恒温箱中，保存4h检查活力。2、细管冻精的解冻技术和解冻方法在使用细管精液过程中，首先必须按照冷冻精液的规程操作，虽然细管冻精不易受外界 环境污染，但标准化、规范化的技术操作也是确保受胎率，避免生殖系统感染病菌的重要措 施。具体操作步骤为： 检查细管体细管冻精从液氮中取出后，首先检查细管体是否有裂纹和封口不严的现象，如发现有裂 纹者，该支细管冻精应弃之不用，如属封口不严，则解冻时可封口不严的一端朝上放入40C 左右的恒温水中进行解冻，尽量避免因解冻方法不当而导致解冻后精子活力不强乃至死亡的 人为因素。 解冻首先准备40C左右的恒温水，恒温容器的准备与颗粒冻精解
11、冻法介绍的相同，细管冻 精从液氮中取出后，手拿细管上端（封装精液后封口），立即放入恒温水中并轻缓游动，以保 持其管壁受热均衡。经2030秒钟后即可解冻完毕。目前全国各地较为普遍使用此种解冻 方法的解冻效果好且受胎率高，除此种方法外，也有其它几种方法可供参考，但不提倡广泛 使用。如搓解冻法将细管冻精放在两手掌间来回反复搓动升温，以达到解冻目的;自然 解冻法将细管冻精放在室内常温下，让其自然升温，以达到解冻的目的;人体体温解冻 法将细管冻精放在人体贴身衣袋内使其升温，以达到解冻的目的，另外，也有将细管冻 精不经过人工解冻过程，而是将冻精装在输精枪上直接输精，靠母牛阴道及子宫颈温度来解 冻。除了 4
12、0C恒温水解冻方法外，无论其它任何一种解冻方法，它们完成解冻的时间都较 长，违反了快速解冻的原则，所以，不提倡在生产中应用，只宜用于研究解冻方法的对比试 验。解冻后的精液如需异地输精，且间隔时间在2小时以上的情况下，其解冻后的精液一定 要放在保温杯中方能保存运输。其操作方法是：将解冻后的精液用脱脂棉或卫生纸包好放入 塑料袋内置入保温杯中，盖好杯盖即可。 细管剪口冻精解冻后，一定要用消毒纱布抹干细管外围水分，再用细管剪口专用剪刀去人工粉装 封口或机械封口一端，切切注意，剪口要正，断面要平整，严禁剪口呈偏斜状，否则输精时 会发生精液逆流而影响输精效果。 细管精液装枪将细管输精枪的管嘴拧下，把推杆退
13、到与细管长度大约相等的位置，将细管剪口的一端 朝管嘴前端放入管嘴内，一手握细管，一手握管嘴，两手同时稍用力将细管的管嘴内旋转一 周，使细管剪口端与管嘴前端内壁充分吻合，以防输精时精液倒流至输精枪管嘴内，然后将 细管有栓塞的一端套在推杆上，拧紧管嘴即可输精。B6精子顶体完整率的检查主要器材和材料显微镜、载玻片、血球分类计数器、小吸管、蒸馏水、姬姆萨染料、磷 酸二氢钠、磷酸氢二钠、甲醛、甲醇、甘油、所用试剂为ARB6.1试剂配制a. 已磷酸盐缓冲液磷酸二氢销(NaH2P04 2H20) 0. 55g磷酸氢二钠(Na2HP04 12H2 O) 2.25 g双蒸馏水定容至lOOmL。b. 中性福尔马林
14、固定液40%甲醛HCHO(使用前经碳酸镁中和过滤)&OmL磷酸二氢钠(NaH2P04 2H20) 0.55g磷酸氢二钠(Na2HP04 12H2 O) 2.25 g用0.89%氯化钠约50.0mL溶解后加入&OmL中和后的甲醛，再加0. 89%氯化钠溶液定容至 100.0mL。c. 姬姆萨原液姬姆萨染料1.0g甘油(C3H5(0H)3) 66.0mL甲醇（CH3OH） 66.0mL姬姆萨染料放入研钵中加少量甘油充分研磨至无颗粒为止，然后将甘油全部倒入并放人 恒温箱中保温继续溶解4h,再加甲醇充分溶解混匀，过滤后贮于棕色瓶中待用，贮存时间 越久染色效果越好。d. 姬姆萨染液姬姆萨原液2.0mL磷
15、酸盐缓冲液 3.0mL蒸馏水 5.0mL现配现用B6.2制片染色a抹片取解冻后精液一滴滴于载玻片一端，用另一边缘光滑的载玻片与有样品的载玻 片呈35。夹角，将样品均匀地拖布于载玻片上，自然风干（约5min）。b. 固定在已风干的抹片上滴上l-2mL中性福尔马林，固定15min后用清水缓缓冲去固 定液，吹干或自然风干。C.染色将固定好的抹片反扣在带有平槽的有机玻璃面上，把姬姆萨染液滴于槽和抹片之 间，让其充满平槽并使抹片接触染液，染色l5h后用清水缓缓冲去染液，凉干待检。d. 镜检将制备好的抹片在显微镜（lOOO倍油镜）下观察。e. 每样品制作二个抹片，每个抹片观察200个以上的精子（分左、右二个区），取二片的 平均值，二片的变异系数不得大于20%，若超过应重新制片。f. 精子顶体完整率计算顶体完整精子数顶体完整率（%）= X100精子总数B7精子畸形率的检查B7.1制片染色按照B5.2B7.2畸形精子率的计算畸形精子畸形精子率(%)= X100精子总数B8冻精中细菌数的检查主要器材和材料培养箱、超净化工作台、三角烧瓶、烧杯、量简、玻律、天平、牛角匙、 高压蒸汽灭菌锅(或微波炉)、培养皿、水浴箱、PH试纸(PH5
