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1、原发性高血压相关基因的SNPs关联分析一、立论依据基因组计划(humangenomeprojectHGP)的完成及多个物种基因组的完全测序1.2.3，为人们系统地研究基因功能及相关遗传病提供了极大的帮助，人类基因组计划的完成还促进了单核苷酸数据库的建成，并由此兴起了一门新的学科单碱基多态性学(SniPs,SNPology)4。SNPs是继限制性片段长度多态性和微卫星多态性这两种遗传标记之后，出现的第三代DNA遗传标记”单核苷酸多态性是指在基因组内DNA中某一特定核苷酸位置上存在转换、颠换、插入、缺失等变异所引起的DNA序列多态性，即SNPs是染色体DNA序列的某个位点上存在的单个碱基变化，如果
2、在较大数量的人群中发生频率超过1%，即可认为是较古老的SNPs，而不是新近个体的突变事件。理论上，SNPs可以分别为二等位、三等位、四等位基因，也即DNA序列中某一位点的碱基可以是四种单核苷酸中的任意两种、三种或全部四种。然而，实际上在人类基因组中一般表现为二等位基因(biallelic),即二态性标记，非此即彼。正因为这二态性标记，在基因组筛查中往往只需+/-的分析，而不用分析片段的长度，这有利于自动化技术的应用。SNPs在人类基因中数量多，分布广，平均不到1000bp个中就存在一个SNPs位点，即在人类30亿碱基中至少有300万个SNPs5.6。可能是选择压力的原因，SNPs在基因组中的分
3、布是不均匀的7。根据SNPs在基因中的位置可分为编码区SNPs(codingregionSNPscSNPs)，基因周边SNPs(perigenicSNPspSNPs)和基因间SNPs(intergenicSNPsiSNPs)三类。不同的区域出现的频率不同，彼此可相差100倍7。编码区域核苷酸多样性为其他区域的四分之一，而且其中约一半为非同义突变8。随着基因组计划的完成，人类即进入了后基因组时代，后基因时代的重点已由全基因组序列测定转移到了对基因组中个体基因多态性和功能的研究9。个体基因多态性的主要形式是SNPs，随着分子生物学,分子遗传学及生物信息学等学科的发展，使人们认识到主要是基因组DNA
4、序列中的这些SNPs变异造成了人类在身材、体形、肤色、对疾病的易感性、疾病表型和对药物治疗反应等方面的显著差异。自从1996年10SNPs被公认为第三代DNA遗传标记以来，研究SNPs与疾病的相关性方兴未艾。随着分子生物技术的日新月异，遗传药理学、药物基因组学也得到了强有力的推动，个体化医学的概念也在此背景下逐步发展起来。怎样基于遗传药理学的发展而发展个体化医学，已成为现实可能,并开始在临床医学中得到逐步实践。疾病基因SNPs多态性的研究，需要考虑每一单个疾病的病理生理特点，选择合适的侯选基因，研究基因多态性与临床表现型之间可能的内在联系，进而分析基因多态性对特定基因功能的影响。从疾病基因型来
5、剖析疾病临床表现多样性，有助于从基因水平重新认识疾病的本质，使我们朝着个体化临床医学的方向迈进了坚实和关键的一步11。原发性或遗传性高血压(essentialhypertensionEH)研究的主要任务是阐明血压升高的遗传机制，也就是寻找高血压相关基因。对这一研究的突破不仅能使我们更好地理解高血压发生的病理生理机制，而且还能指导我们对原发性高血压进行早期诊断、预防和治疗。原发性高血压是一种危害人类健康的常见病，有明显的家族聚集倾向。这种复杂的多基因病是由遗传因子和环境条件共同决定的，遗传因素较环境因素更具重要意义。其中，遗传因素在原发性高血压发生中的比率约占30-50%。若干微效共显性基因的累
6、积效应导致这个复杂疾病的遗传。迄今为止，已研究了一系列相关基因，包括肾素-血管紧张素-醛固酮系统的位点，上皮钠通道的位点，儿茶酚胺/肾上腺素能的功能位点，肾激肽释放酶-激肽系统位点，-内收蛋白的位点，脂蛋白代谢，激素受体或生长因子基因位点等，但基于单一基因所作的关联分析结果并不完全一致12。Halushka等在74个欧洲与非洲后代中研究了高血压侯选基因的SNPs，发现了874个侯选SNPs，这些SNPs在基因组中存在的区域较广，且在不同病人亚群中植家泊嬖诓钜臁?鉴于RAS系统在血压调节中的重要作用，以及ACEI/D基因多态性的研究成果，我们拟研究高血压基因的多态性，通过对ACE中I/D及几种血
7、管舒缩相关基因SNPs多态性的分析，以定量不同基因在原发性高血压发生发展中的作用。血管紧张素转换酶（ACE）基因为单拷贝基因，位于染色体17q23,包含26个外显子和25个内含子，大约21kb。通过定量特征连锁分析，证实血管紧张素转化酶ACE基因位点与血压连锁13，在ACE位点第16个内含子上有一段的缺失/插入多态性，此多态性可影响这一基因的表达，影响ACE活性水平，ACE基因多态性分布在不同的种族中有明显的差异14.15。人类血管紧张素原基因（AGT）为一单拷贝基因，位于染色体1q42-43，大约13kb，由5个外显子和4个内含子组成。在AGT基因中有一种错义突变，即外显子2的704位核苷酸
8、发生T-C转换，造成第235位氨基酸M（甲硫氨酸）一T（苏氨酸）的置换，简称M235T等位基因，研究表明16-18血管紧张素原基因的M235T等位基因与高血压的风险性增高相关。然而，也有一些研究未发现AGTM235T等位基因与高血压相关19。ATIR基因也为单一拷贝基因，位于染色体3q21-25,大约2.2kb，由5个外显子和4个内含子组成20。有研究21发现该基因的A1166C多态性与高血压相关，但也有研究22表明ATIR此多态性位点与对中国香港人高血压病的发生未发现具有作用。这三者的关系：肾素是肾脏血小球旁器分泌的一种糖蛋白，具有蛋白水解酶活性。在循环血液中，肾素可以使血管紧张素原C端两个
9、氨基酸之间的肽键断裂成ATI，ATI在ACE作用下生成ATII。在人类SNPs数据库中，有关AGT、ACE、ATIR、RENBP、Endothelin-K198N的SNPS位点很多，但为什么人们只集中在上面几个SNPs位点的研究，且研究结果不一致呢？由于研究对象种族不同，样本抽取方式、标准及研究方法不同，使某些研究结果不一致以及不可重复性，其中更关键的问题是缺乏高特异性、高敏感性的SNPs的检测方法。SNPs的分析方法按其研究对象主要分为两大类，即，对未知SNP进行分析，即找寻未知的SNP或确定某一未知SNP与某遗传病的关系；对已知SNP进行分析，即对不同人群SNP遗传多样性检测或在临床上对已
10、知致病基因的遗传病进行基因诊断。本实验利用一种新的基因多态性检测方法进行SNPs的分析，即高保真DNA聚合酶介导的三末端硫化修饰引物延伸反应23，这两者联合使用时，构成了一种对SNPs具有高度辨认能力的纳米级复合分子“开/关”系统24。工作原理：根据引物三末端不配对碱基降低引物延伸反应效率的原理，本方法使用具有35外切酶活性的高保真DNA聚合酶与三末端硫化修饰的等位基因特异性引物进行引物延伸反应。在通常反应条件下，引物三末端与待测DNA模板配对时，能得到引物延伸产物，即达到“开”的效应；引物三末端与待测模板不配对时，则不能得到引物延伸产物，即达到关的效应。方法特点：该方法使用了具有三外切酶活性
11、的高保真DNA聚合酶，引物三末端须采用耐核酸外切酶的修饰如硫化修饰，SNP特异性碱基可位于三末端或近三末端。该PCR反应的高度特异性，可用于多重PCR分析多个SNP位点。本实验利用此方法来进行高血压相关基因SNPs的研究，通过关联与连锁分析，确定高血压相关基因及SNPs与高血压的关系。本实验拟采用DNApooling技术检测SNPs25-26参考文献1GenomeInternationalsequencingconsortium.Nature,2001,429:806-921.2刘万青，贺林。SNP-为人类基因组描绘新的蓝图（J）.遗传，1998,20（6）：38-40.3Nei,MMolec
12、ularevolutionarygenetics（M.ColumbisuniversityPress.NewYork,1987,pp28-29.）4ZhangJandLiK:Terminallabeledprimerextension:AnewmethodforSNPanalysisandexpressionprofiling.CurrentDrugDisc,2001,9:21-23.5 SherryST,WardM,SirotkinK.UseofMolecularvariationintheNCBIdbSNPSelectabase(J)HumanMut,2000,15:68-756 Nike
13、rsonDA，TaylorSL，WeissKM，etal.DNAsequencediversityina7.9Kbregionofthehumanlipoproteinlipasegene.NatureGenet1998,19:233-2407 HalushkaMK，FanJB,BentleyK，etal.Patternsofsingle-nucleotidepolymorphismsincandidategenesforbloodpressurehomeostasis(J).NatGenet,1999,22(3):239-2478 CargillM,AltshulerD,IrelandJet
14、al.Characterizationofsingle-nucleotidepolymorphismsincodingregionofhumangenesJ.NatGenet,1999,22:231-239.9 BurleySK,AlmoSC,BonannoJB,etal.Structuralgenomics:beyondthehumangenomeproject.NatGenet,Oct1999,23(2):151-157.10 LimaJJ,ThomasonDB,MohamedMH,etal.Impactofgeneticpolymorphismsofthebeta2-adrenergic
15、receptoronalbuterolbronchodilatorpharmacodynamics.ClinPharmacolTher,May1999;65(5):519-25.11张维利，易建中。原发性高血压相关基因研究进展。国外医学遗传学分册，2002，25(5)：279-282。12Hubert，HouotAM，CorvolP，etal.StructureoftheangiotensinIconvertingenzymegene:twoalternatepromoterscoresspondtoevolutionarystepsofaduplicationarystepsofadupli
16、catedgene(J).JBiolchem.,1991,266:15377-15383。13SchunkertH,HenseHW,HolmerSR.,etal.AssociationbetweenaDeletionPolymorphismoftheAngiotensin-Converting-EnzymeGeneandLeftVentricularHypertrophy(J)N.Engl.J.Med.,Jun1994;330:1634-1638.14 刘志红，陈朝红，关天俊，等。南方汉族人群血管紧张素转换酶基因多态性的分布特点(J)。中华医学杂志，1996，76(10)：778-779。15 BoreckiIB，ProvinceMA，LudwigEH，etal.Associationsofcandidatelo
