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1、实验十 菌落 PCR 筛选阳性重组子【实验目的】学习利用菌落 PCR 技术筛选阳性重组子的方法【实验原理】细菌细胞内的重组 DNA 以裸露状态存在。在高温条件下，细菌细胞破裂， 细胞内DNA暴露并因高温的作用而变性成为单链状态的DNA，此时该DNA可 作为模板用于PCR,进而检测该DNA中是否含有重组的外源DNA序列。【仪器、材料与试剂】1 仪器生化培养箱，超净工作台，离心机， PCR 仪，电泳仪，电泳槽，连续可调 移液器，凝胶成像系统2 材料含待检测菌的阳性筛选平板,PCR试剂盒，引物(primer 1)和引物2(primer 2)，PCR管，移液器枪头，ddH20,电泳级琼脂糖，Tris碱
2、，硼酸。3 试剂PCR 试剂盒：10X PCR buffer，MgCL2 或 MgS04，dNTPs，DNA 聚合酶；primer 1和primer 2：均配成10ymol的使用液；DNA Marker:根据PCR产物大小确定。实验步骤】1配制25L的PCR反应体系10X buffer2.5 yLMgCL2或MgSO41.52.5yL (若buffer里有，则可不加或少加)dNTPs (2pmol)2.5yLprimer 1 (10pmol )1yLprimer 2 (10pmol )1yLTaq酶(或其他用于PCR扩增的DNA聚合酶)1UddH20补至 25yL最后用移液器挑取筛选平板中的待
3、检测菌落，放入上述反应体系中。2 PCR程序配制好反应体系后，将其放入 PCR 仪中。然后根据最初设计引物时的相关数据，设定PCR程序中的每一步的反应条件。通常设计的反应条件如下：94 C预变性35min；94C 变性30seclmin 5060C退火 lmin丫 3035个循环72 C 延伸 2min72C 最终延伸 8l0min设定好程序后，即可开始运行程序，进行 PCR。3 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测见实验六PCR完成后，取58此PCR产物与适宜的上样缓冲液(loading buffer )混匀后，加样电泳。待电泳完成后，将凝胶置于凝胶成像系统中观察结果。 【注意事项】1 配制 PCR 反应所用 PCR 管及移液器枪头要洁净、无菌，反应体系配制时要仔细， 防止液体飞溅。2 要选取清晰、散落的菌落进行挑菌，防止沾染其他菌落或杂菌。【思考题】1 菌落 PCR 扩增时应注意哪些问题？2 菌落 PCR 扩增鉴定阳性重组子的依据是什么？
