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1、GPCR让无数英雄竞折腰20世纪90年代后期，加州大学OlivierCivelli实验室的Irvine与十几个研究人员忙着投入到寻找一条重要分子信号途径的缺失的联系中。这一途径一半的组分已经被阐明，就像几百种G蛋白偶联受体（GPCR）通过DNA筛选被鉴别一样。然而，仍然缺少某一组分，即与受体结合的信号诱导分子，或者准确的称之为配体。Civelli团队不是唯一从事这项研究的团队，目前，全球有大量的研究团队竞争去鉴别这些“孤儿受体”所缺失的配体，这些孤儿受体主要是一些配体有待发现的GPCR。1986年到2006年间，大约有300个孤儿受体找到了它们的天然配体，正是这些配对刺激了学术界和医药研究者对
2、于治疗的潜能更具信心。GPCR研究概况目前，800个已知的GPCR中有30%是药物靶点，上千种已上市药物中接近一半是针对GPCR的，大约800个G蛋白偶联受体基因是人类基因组中最大的基因家族。它们编码一个膜结合受体的超家族，能探查大量的细胞外信号分子，作为对这些分子的回应，在细胞内呈现信号级联反应。GPCR控制着机体无数的进程，包括消化、视觉、嗅觉和心跳，使这些受体家族具有极大的治疗潜力。800个受体中大约一半为化学感受相关受体，这些不太可能为药物位点，而另外一半已经或者未来某天可能成为药物靶点。尽管取得了这些进展，但是在2004年，仍然有约100个未配对的孤儿GPCR，这一领域的发展戏剧性地
3、放慢了。Civelli的团队缩小了，目前他实验室的7个研究人员中，只有2个进行GPCR的脱孤研究，并且他们在超过三年的时间里未有任何的结果发表。苏格兰Glasgow大学一名教授GraemeMilligan说道“当你和这个领域的人谈论的时候，他们都说感到些许失望。”不过，慢慢的，针对GPCR的药物开始涌现：去年，辉瑞发布了新的抗人类免疫缺陷病毒（HIV）药物Maraviroc,专门针对HIV结合人类T细胞必需的趋化因子受体CCR5；2006年，杨森制药推出了Paliperidone,这是一种新的针对5个曾经孤儿的神经性GPCR、治疗精神分裂症的药物；而Corthera制药公司治疗心衰的药物rel
4、axin正要通过三期临床，这是一种针对曾经孤儿的LGR7受体的药物。种种迹象表明，我们正在收获辛勤经营了20年的果实。孤儿受体研究快速发展传统上，研究人员研究信号转导途径经常始于实验或组织的离散生理学反应，随后的更深入的研究将揭示它结合的受体和配体。许多GPCR的发现采用了相反的途径：研究人员在不知道受体功能或配体的情况下鉴别出了受体。1986年，杜克大学的RobertLefkowitz团队成功克隆了B2-肾上腺素能受体（beta2AR），随后发现了第二信使一一在B2AR例子中是cAMP引起细胞内诸如心跳加速或瞳孔放大的反应。这一受体和七次跨膜的受体视紫红质高度同源，视紫红质属于夜光感物质，是
5、当时唯一一个通过G蛋白起作用的受体。新的B2AR的基因组序列暗示有一个新的受体家族存在，并且它们通常都有共同的结构。尽管职业生涯刚开始不久，当时属于美国奥勒岗健康科学大学Vollum研究所的Civelli打赌说他能够使用B2AR的基因序列来筛选相似受体的基因。同年，杜克研究组发表了Civelli使用克隆的B2AR为探针筛选鼠基因库的文章。当时，许多研究者告诫他这一方法成功的希望很小，他的团队将不可能发现任何新的受体。其他研究人员一直在使用DNA同源性来寻找新的基因，但由于Civelli只使用两个其他的模型一一视紫红质和B2AR这就有很高几率的假阳性结果。“人们告诉我这就像是一场摸底调查，”他说
6、，“我得到了许多数据但是没有任何结果，”在这里，结果就是指受体。人们告诉我这就像是一场摸底调查，我得到了许多数据但是没有任何结果OlivierCivelli1987年春天的一个晚上，研究助理JimBunzow告诉Civelli，根据研究数据得知，其中的一个克隆含有两个跨膜区域（通过筛选鉴定）。Civelli看了看数据，发现其序列与已知的B2AR序列非常相似：他们发现了一类新受体的基因。Civelli的新受体被证明是D2受体，是多巴胺受体家族5个亚型中的一个。“这一发现足以表明此方法可用于发现新受体，”Civelli说道，“这是我职业生涯中最精彩的一刻。”这一受体跨膜七次而没有配体，这是最初发现
7、的两个“孤儿”GPCR中的一个（另一个是5羟色胺受体5-HT1A），尽管当时“孤儿受体”这一名称还没有出现。Civelli继续研究发现这一受体在大脑内优先表达，特别是尾状叶、壳和垂体。“这提示我们它有可能是D2受体，”他说，因为只有D2在脑下垂体中表达。这一团队使用假定的受体基因转染细胞来验证是否可以表达受体。Civelli分离了细胞膜并使用D2受体拮抗剂氟哌啶醇（haloperidol）进行处理，氟哌啶醇是许多制药公司用于治疗精神分裂症的药物。在知道这一受体的序列或结构之前，氟哌啶醇与Civelli的受体结合能力与制药公司使用D2受体在鼠脑内进行的试验具有同样的亲和力，Civelli的受体是
8、D2受体，而不再是孤儿受体。孤儿受体领域呈现爆炸式发展。“起初的研究工作被鉴定新受体所获得的兴奋所驱动，”目前是ThomasJefferson大学Kimmel癌症研究中心教授，同时也是杜克大学B2AR克隆文章的作者之一的JeffreyBenovic说，“上个世纪80年代及随后的十年，都有许多令人兴奋的事件，从那时起你会一直留在实验室进行最基本的脱孤研究。”最终的目标是鉴别出药物新靶标。使用Civelli的同源筛选技术，接着用基于序列同源性的更快速的以PCR为基础的手段，研究人员鉴定出了几百种没有配体的受体。为了给受体寻找配体，研究人员通过DNA转染真核细胞来表达受体。他们将这些受体暴露在组织提
9、取液中，以期获得其中所含的天然配体一一设想一下，在许多情况下，配体存在于大脑或者内脏中，例如，它们依赖于孤儿受体与其它受体的同源性。第二信使反应的变化意味着孤儿受体已经找到对应配体，研究者也通过合理的猜想寻找测量这些反应。上世纪90年代中期，高通量的筛选工具已经大量用于检测第二信使反应。得益于上个世纪90年代高通量试验技术的发展，研究人员平均每年可以脱孤10个受体，这一情况延续了将近20年。即使如此，80年代和90年代寻找缺失的配体和脱孤受体仍然是分子生物学未曾涉足的领域。为了寻找这些未知配体，研究者必须面对两种未知情形：传送者的特性（有可能发现配体的组织的类型）和第二信使的特征。在不到20年
10、的时间里，产业界和学术界快速发展使大约300个受体脱孤。“到2002或者2003年，我们突然发现有过多的靶标，”Civelli如是说。于是，寻找发现配体的速度发生了巨大变化。脱孤研究放缓在极度活跃和成功之后，脱孤研究进入了另一个阶段，研究者每两到三年仅仅能鉴别1个配体，这一古老的脱孤技术几乎停止了工作。目前，大约有100个孤儿GPCR没有找到天然的配体。为何会这样？“我认为其中原因之一可能是这些GPC受体根本就没有对应的配体，”英国剑桥大学临床药理学院的研究员AnthonyDavenport说道。Civelli认为，在20世纪90年代受体数量远远超过配体数量；没想到只经过十多年这种受体和配体极
11、易配对的情况就消失了。现在，一些原来研究配体的人员开始把工作重点转移到确定孤儿受体的功能和解释为何它们的配体如此难以寻找方面。目前，“学术实验室99%有关GPCR的工作集中在试图更好地阐述受体的功能上从结构层面到整个生物学层面，”Benovic说道。他的团队集中研究受体自身下游蛋白的表达，即arrestin和GPCR激酶（GPK），这些蛋白前后协同调节GPCR在细胞内的相互作作用。同时，研究发现一些受体不是单独的以同源二聚体起作用，而是与其他受体结合成异源二聚体发挥功能。2006年发现，孤儿GPR50受体在某种情况下会抑制另一受体，范德比特大学药物开发项目的负责人JeffreyConn认为这一
12、发现使研究人员不知所措。通过对在睡眠信号系统起作用的MT1褪黑激素受体的二聚化，GPR50阻止了MT1的信号级联放大。因此，研究人员从来没发现GPR50的天然配体，因为它根本就没有：它最基本的功能是和其它受体共同发挥作用。时间的选择也许是另一个阻止脱孤研究的因素。Civelli说：“一些配体缺失是因为我们不知道何时去找到它们。”例如，一些配体只在有机生命的特定时期或者在特定条件下表达，这些配体“有可能呈现很低的水平，或者仅仅在一些特殊反应发生的时候分泌。如果我们不知道这些反应何时发生，那我们就不能找到配体，甚至不知道如何寻找它。”一些受体，尽管它们通过G蛋白起作用，但有可能根本就没有第二信使，
13、而是与其它不明确的转导途径有关系。另一些受体可能结合不止一个配体，一些有可能需要辅助蛋白的表达来发挥作用，这些都比传统的单独表达受体的研究更复杂。“那种受体唾手可得的时代已经过去了，”Conn说道。对于放缓寻找孤儿受体的配体的研究，制药公司有另外的理由。Davenport表示，公司停止脱孤研究是因为公司认识到已经有太多的GPCR了，药理学必须要赶上分子生物学方面的配对研究。大多数情况下，新的传导系统就像是一块空白的油布，他们对配体或者受体知之甚少。不断攀升的证据表明这些受体对于生物的发育和其它过程具有重大影响，这意味着即使是孤儿受体也可能具有非常重要但未被发现的作用：最新在老鼠和人体的研究发现
14、，曾经的孤儿受体GPR54突变导致功能失效，青春期无法开始；而受体过量的表达又导致早熟。据Lundbeck公司GPCR研究首席科学家MaryWalker介绍，20世纪90年代中后期，Lundbeck制药公司（原为Synaptic）在新泽西州Paramus的125名员工的三分之一致力于GPCR的脱孤研究。现在，已经没有一个人在研究这个项目了。脱孤GPCR药物进展“90年代后期我们花了大量的力气用于各种支持脱孤的活动，”Walker说，包括开发完整的功能试验、记录信号输出细胞报告因子以及细胞表面标记等。目前，公司已经遣散脱孤研究项目，转而研究机体更大背景下公司称之为系统生物学一一的神经性GPCR的
15、功能。脱孤研究是“一种机会性的手段，缺乏有力的科学原理。你不知道你要发现的东西未来是否有用。”此外，Walker认为，GPCR脱孤研究及随后描绘它们如何起作用所需要投入的资源变得非常昂贵，更不用说针对它们开发药物了。通常，一个脱孤研究项目从长远角度会花费更多的资金，因为按照定义，研究又更多的回到了生物学产品线，在投入资源之前，研究人员对功能和潜在的疾病关系知之甚少。现在，Lundbeck的研究人员利用基因芯片和基因表达来鉴定疾病状态下除GPCR外发生改变的其它因子。Walker说：“人们认为这已经成熟了，因为其它的技术能提供我们需要的靶标。”强生、惠氏和武田制药公司均拒绝对自己的孤儿GPCR药
16、物研发项目发表评论。“迄今为止，没有任何药物是通过脱孤受体取得成功的，”Milligan说。“部分是因为时间的关系，但是许多极易脱孤的受体在控制生理方面没有起到重要作用；它们对于工厂生产的B阻滞剂或抗组胺药物的作用途径没有影响。”“我仍然认为有许多靶标在那儿；GPCR在制药领域会有复兴的一天。”AnthonyDavenport。尽管如此，脱孤GPCR药物方面的进展并没有表面看起来这么令人失望。根据Civelli近期的一篇综述，至少有14个针对脱孤GPCR的药物处于开发阶段，其中一些已经进入三期临床。一些后期临床项目包括针对食欲信号转导中的脱孤的增食因子(苯基二氢喹唑啉，orexin)受体。Milligan说，虽然orexin受体10年前就已经脱孤，但是理解其功能花费了不少时间，因而增加了寻找临床化合物的时间。Lundbeck的药物产品线中有十多个是针对曾经是孤儿GPCR的。过去几年,几个很有希望
