蛋白质的定量分析方法

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1、蛋白质的定量分析方法1 蛋白质的常规检测方法1.1 凯氏定氮法一种最经典的蛋白质检测方法。 原理：样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催 化 剂作用下共热消化， 含氮有机物分解产生氨， 氨又与硫酸作用变成硫酸铵。 然 后加 碱蒸馏放出氨， 氨用过量的硼酸吸收， 再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换 算为蛋 白质含量。 优点： 范围广泛、测定结果准确、重现性好。 缺点：操作复杂 费时、试 剂消耗量大。1.2 双缩脲法常用于需要快速但并不需要十分精确的蛋白质检测。 原理：双缩脲是三分子 的 脲经180C左右加热，放出一份子氨后得到的产物，在强碱性溶液中，双缩脲与硫酸 铜形成紫色络合物（肽链中的氮原子和铜离子

2、配价结合） ，称为双缩脲反 应。紫色络 合物颜色的深浅和蛋白质浓度成正比，因此可用来测定蛋白质含量。 优点：较快速、 干扰物质少、不同蛋白质产生的颜色深浅相近。 缺点：灵敏度差、 三羟甲基氨基甲 烷、一些氨基酸和 EDTA 等会干扰该反应。1.3 Folin 酚试剂法原理： 与双缩法大体相同，利用蛋白质中的肽键和铜离子结合产生双缩脲反应。 同时 也由于 Folin 酚试剂中的磷钼酸 -磷钨酸试剂被蛋白质的酪氨酸和苯丙氨酸 残基还 原， 产生深蓝色的钼蓝和钨蓝的混合物。 在一定条件下， 蓝色深度与蛋白 的量成正 比，由此可测定蛋白质的含量。 优点：灵敏度高、对水溶性的蛋白质含 量的测定很有 效。

3、 缺点： 费时，要精确控制操作时间； Folin 酚试剂的配制比较 繁琐，且酚类和 柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油、还原剂（二 硫代苏糖醇、巯基 乙醇） 、 EDTA 和尿素均会干扰反应。1.4 紫外吸收法原理： 蛋白质中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基使其在 280nm 处具有紫 外吸收，其吸光度与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在280nm 处的吸光值与肽键含量成正比。 利用一定波长下蛋白质溶液的吸光值与蛋白质含量的正比 关系 可以测定蛋白质含量。 优点： 简便、灵敏、快速、不消耗样品，测定后能回 收。缺 点：测定蛋白质含量的精确度差、专一性差；干扰物质多，若样品中含有

4、 嘌呤、嘧啶 等能吸收紫外光的物质会出现较大的干扰。1.5考马斯亮蓝法（Bradford法）原理：考马斯亮蓝G250在酸性溶液中与蛋白质 中的碱性氨基酸（特别是精 氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合（蛋白质与染料间的疏 水作用也很重要），使染料最大吸收峰的位置从465nm变为595nm,溶液的颜色也 有棕黑色变为蓝色， 在 595nm 下测定的吸光度值与蛋白质溶度成正比。 优点：灵敏 度高， 测定快速、 简便，干扰物质少，不受酚类、游离氨基酸和缓冲剂、络合剂的影 响，适合大量 样品的测定。 缺点：由于各蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸含量不 同， 因此用 于不同蛋白质测定时有较大的偏差。Bradfo

5、rd 法一般注意事项： 1.不要用石英杯做比色（染料会与之结合） ，使 用玻璃或塑料为佳，使用后用甲醇或去污剂来洗掉结合的痕量染料； 2.若用同一 比色 杯，应先测定低浓度样品避免误差；3选择570-610nm波长；4使用不同公司生产 的染料可能得到不同结果； 5.使用高质量试剂和水； 6.要使样品浓度落在标准曲线线性范围内；7.最好用丫球蛋白或卵清蛋白，因为 BSA 会比其他多数 蛋白 质结合多一倍的染料，所以用BSA 时会低估蛋白质含量，但是测定血清蛋白时使用BSA更准确。般实验步骤：1染色液配制：取100g考马斯亮蓝G250溶于50ml95%乙 醇 中，再与100ml85%磷酸混合，用蒸

6、馏水补足至1L。使用Whatmanl号滤纸过滤后置 于棕色瓶中室温保存即可，若有沉淀产生用前应过滤。 2.酶标板（96 孔） 测定：取0、2、4、6、10、15、20ul的BSA标准蛋白质溶液（1mg/ml）至U酶标板 孔中；取最多 20ul 蛋白质样品到单独孔中；加入 40ulBradford 试剂到所有孔；加水补足到200ul；测定 595nm 处吸光值。种改良的 Bradford 法：尽管Bradford法抗干扰能力较强，但是一些碱性试剂（尿素、碱性载体两 性电 解质）还是会影响 G250 与蛋白质结合。所以在加入染料之前使用酸来中和 样品能够 改善效果。由于有未与蛋白质结合的自由染料存

7、在，所以测定的标准曲线不是线性的（做标准曲线要准确些）。据报道，使用 595nm 和 450nm 双波长测 定 可以有效解决这问题（水做空白组），在增加准确度的同时，还能够将灵敏 度提高 十倍。（注意：样品中含有 SDS 时不使用该方法）实验步骤：准备阶段：染色液：按照常规配制，4C保存；裂解液：9mol/L尿素、4% （体积 分数） NP-40、 20g/L 的两性电解质、 2%巯基乙醇；蛋白质标准品：用样 品溶液（裂 解液）配成5mg/L，分装-20C冻存以保证重复性（-20C保存6-8个月、-80C保存1 年）实验操作：从-20 C 冰箱中取出标准品和裂解溶液，充分溶解；标准品 1200

8、0rpm,3mi n；样品 12000rpm,20min 使之澄清；新鲜配制01mol/LHCI（10ul/管）并加入纯水（80ul每管）；按下表数值分别配好标准品、样品溶液，轻轻混匀（振荡仪）：标品含量ug510152025304050标品体积ul1r2 1 34 156810样品体积ul98765420盐酸ul10r 1011010 110101010水ul8080808080808080过滤染色液后每管加取3.5ml，用振荡器轻微摇匀5min ；595nm 检测。用次性比色杯（反应 5min 可充分显色，但 10-15min 沉淀开 始出现，尤其高溶度蛋白在酸性条件下易产生沉淀）； 做标

9、准曲线计算分析。2. 蛋白质的电化学检测方法2.1 蛋白芯片技术 原理：将各种蛋白质固定于载玻片等各种载体介质上成为检测的芯片， 然后 用 标记特定荧光物质的抗体与芯片上的蛋白质相匹配结合， 抗体上的荧光将指示 对应蛋 白质及其表达数量。 优点：快速、低成本2.2电化学免疫传感器原理：电化学免疫传感器是基于抗体抗原反应， 可进行特异性定量分析的自给式 的集成器件，抗体、抗原是分子识别原件且与电化学传感元件直接接触， 并通过 传感元件把某种化学物质浓度信号转变为相应的电信号。3. 蛋白质的分子生物学检测方法3.1 邻位连接技术原理首先将不同射DMA单糙分别与蛋白质识别分子拥结合影成PLA探针，经

10、过粪似酶聯免疫吸 附进（elisa :中的温育过程，2条含有不同DNA序列的PLA探针会同时结合到同一个待 訓蛋亘后分子上吐时.2条探针的DNK屋部便在空闾上紧密靠近.在过量的互补连接序刃 和NDA译接陋闲作用卜2条探豺DNA尾部的游离亍端和T端与互补库夕J杂交并发生连 擅反应，总賊一个坏状的蛋白质-蛋白识别分子-单植DMA复合辆。该复合拗i的梦 少，完全專决于样品中待测蛋白质分子故叮用 丁蛋白质的定量分析。优点：检测灵敏度高、检测特异性强、样品损耗低、操作简单、殓和设常见3.2核酸适体 原理；直接在核酸适林上共价修饰荧另基因利用它与靶分子结合时荧光信号的变化实现对 靶分 子的检狈昇修饰有荧光

11、熄灭基团的核醸适体探针通过静电作用 2阳离子荧光共辄 聚合物结 合，导敦后者荧光熄灭，当加入靶蛋白后，核酸适体探軒与其特异性结合， 荧光熄灭基团 与阳蕪子荧光共梔聚合物远离，聚合物荧光信号得以恢复.优点：检测限IK,检测线性范围广3.3 电泳法原理 在喊性潯液4蛋白质将口?+还原成Cu+r阮舟与c结合形咸穗定的蓝紫色复合物，在兀 2nm处具有最大吸收峰，在一定条件下。此复 韧的吸光度与蛋白质液度成正比v优点：试剂单 一，终产物稳定，除丼还原性糅类的T找敬感外，对其也物质包括常用蛋白质増溶的表面活性 物质如5D5等均无影响钛点：反应时间长且蛋白质也会发主不可逆乾变性。3.4二甲酸奎林（BCA）法

12、最初由Smith等建立，同Lowry法类似，也是在碱性条件下有铜离子被还原形成 亚铜离子（还原剂、金属离子螯合剂会产生干扰），亚铜离子通过与BCA反应而被 检测，。Lowry法和BCA法灵敏度相似，但是BCA法在碱性条件下稳定，可以一步 完成 反应且抗干扰能力强，形成的深紫色反应产物最大吸收波长是562nm,在一定条件 下，此复合物吸光度与蛋白质浓度成正比。优点：购买方便、检测速度快、灵敏度高、对大多数表面活性剂不敏感；且 由于 反应在碱性条件下进行，故绝大多数蛋白质保持在溶解状态。缺点：对还原剂、金属离子螯合剂等很敏感，在裂解液中对该方法干扰最大 的成 分是DTT，测定时样品需要充分稀释。标

13、准方法（01-1mg/ml样品）：试剂 A （100ml）: BCA-Na2 1g、 Na2CO3?H2O 2g、 C4H4O6Na2?2H2O0.16g、NaOH 04g、NaHCO3 0.95g,用少量的固体 NaHCO3 或 50% NaOH 溶 液调 节 pH 至 11.25;试剂 B （20ml）： CuSO4?5H2O 0.8g；工作液配制：试剂A :试剂B=50:1 （体积比）混合，该苹果绿溶液可室温稳定一周；试剂A、试剂B在室温下很稳定，可以长期存放；取100ul含有1O-1OOug蛋白质的样品溶液加入2ml工作液，60C孵育30min ；冷却至室温测定562nm （595nm

14、）处吸光度； 使用 1mg/ml 的 BSA 蛋白质标准液稀释作标准曲线。 具体实验操作步骤：1. （将蛋白质样品从-20r转移至4C溶解待用）计算工作液配置量=（样品数 +8+1 ） 200ul=C ml2. 样品稀释与浓缩：实验用BSA容液为2mgml，而样品样品测定时浓度应稀释 或浓缩至标准曲线限行范围内（以最终 ODfi 落在标准曲线中值为优）。稀释：样品浓度过高时需进行稀释，根据要求用双蒸水稀释相应倍数，操作 在向酶标板孔中加样时体现；浓缩：样品浓度过低时需进行浓缩，a将超滤管固定在EP管内，加入400ul样 品，11000rpm 5min,转移EP管底废液；b以离心结果（超滤管内剩

15、余 液面高 低）加样品溶液进行二次、三次离心至样品完全浓缩（最后一次 离心留取400ul左右溶液与超滤管内）；C将超滤管内液体进行反复抽打后 转移至EP管 内。12345678样品ddH20P0510 11517.5T9-r 19.520aBSA(2mgml)20151052.510.50b工作液2002002002002002002002002003. 按下表将各溶液、试剂加取至酶标板孔内：单位：ula+b=20； a、b 值根据稀释倍数而定。4. 振荡仪振荡5min, 37C水浴30min,用干净的细针头扎去大气泡；5. 打开软件设定程序和参数，将酶标仪扳进仪器内进行测定 595nm 处吸光 值，导出数据进行计算。4. 免疫法4.1 免疫扩散法环状免疫单扩散法、将一宇冒的抗体（一骰帯用单价抗G精：与含缓神極的晾腥糖凝 胶逞匀铺成适当厚度的凝胶板，再把抗原爾进褪狡板的小孔巾在合适的浓度和湿 度环 境中，经过一定的时间，抗庾由 M 正向四周扩散（呈辐 狀），勻已沉匀在琼脂糖 橇胶 中的抗獰相互作月.当抗压扩