小分子抗原现在做的最多的是农药和兽药

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1、小分子抗原现在做的最多的是农药 和兽药，这方面的文献也很多。以前 查过一些材料，个人觉得小分子抗原 能否制备出高性能的单克隆抗体主 要以下几点决定。 对于半抗原结构的选择，如果待测物 本身含有 NH2 ，COOH ，OH 等活性 基团，可以利用待测物活性基团加入 间隔臂，然后联入载体蛋白就可以成 功合成人工抗原，制备特异性良好的 抗体（周思祥， 刘福成， 2005 ）。 但大部分待测物上并不含有活性基 团或活性基团对药物的特异性和极 性影响很大，所以大部分用于人工抗 原合成的半抗原要经过改造或从头 合成。例如在关于有机磷农药倍硫磷 的免疫检测方法的研究中，半抗原物 的获得采用的合成方法并不是从

2、倍 硫磷开始合成，而是采用另一途径， 从起始物重新合成，这样反而能取得 较好的效果，这一点对于制备具有多 残留检测能力的抗体来说更为重要， 只需合成出几种待测药物共有的结 构就有可能制备出具有多残留检测 能力的抗体。 ( Yoo Jung Kima ， 2003 ) 待测物本身的结构有时对建立方法 的性能有很重要的影响，在分子量在 111 1202Da 的化合物制备的单 克隆抗体的亲和系数的试验中，半抗 原的分子量在334 -374Da之间时， 制备的单克隆抗体具有很高的亲和 系数。但当要检测的小分子化合物的 分子量小于 300Da 时，产生具有良 好灵敏度和特异性单克隆抗体的可 能性下降(

3、Chappey et al. ， 1994 )。 这说明药物的分子量是影响抗体性 能的重要因素。同时待测物的结构对 于制备人工抗原的难易程度有重要 影响，有些半抗原经过理论分析能制 备出高质量的抗体，但从化学合成的 角度，这些化合物可能是合成不出来 的或工艺过于复杂，所以半抗原结构 能否合成出来，也是半抗原结构设计 过程中要考虑的问题。如果待测物结构过于简单，可能也是 不能建立免疫检测方法的。待测物的 结构最好含有特征性的环状结构或 侧链结构，甚至含有杂原子，都能够 增加制备出高质量抗体的可能性。在 对脂肪酸类物质制备抗体的试验中， 对于脂肪酸类物质来说，如果含有两 个以上的羰基，及与蛋白偶联

4、之后还 有多余的羰基增强亲水性，同时酰基 的不饱和双键和极性的头部结构都 可以做为 B 细胞的抗原决定簇， 可以 将其他抗原性很弱的部分变成强抗 原性。再者如果脂肪酸含有平面结 构，也可以作为抗原决定表位，使产 生特异性的抗体。这说明小分子的极性以及不饱和键，苯环结构都可以增 强抗原性，简单的直链结构很难产生 特异性很强的抗体，这也是一般选用 直链作为间隔臂的原因。直链碳链本 身的抗原决定性很差，不会产生针对 间隔臂的抗体。合成人工抗原的过程中，即使半抗原 绝大部分的官能团与待测物都是一 致的，它也可能在联入蛋白载体的过 程中受到屏蔽作用。小分子药物在与 载体蛋白连接的部位很容易受到屏 蔽。从

5、而产生的抗体就会丧失对那些 屏蔽基团的特异性。确定半抗原不受 蛋白的屏蔽作用在人工抗原合成中 非常重要，解决这一问题的最佳方法 就是联入间隔臂。 间隔臂的连接位点的选择对于抗体 质量至关重要，最好不要影响小分子 化合物中特征性的基团暴露于免疫 B 细胞的抗原表位，这也是待测物本身 的羧基，氨基一般不能直接联入间隔 臂，因为这些基团对小分子药物的电 性和极性影响非常大。而且引入的间 隔臂不能影响主要基团的电子分布， 例如苯环和其他杂环类的电子分布， 这就要求间隔臂的极性和能量要低， 将对小分子药物的电子排布和空间 结构的影响降到最低，从这个角度来 说，低能量的直链间隔臂是最佳的选 择。联入间隔臂

6、的半抗原的电子分布 与目标待测物的电子特性一致性对 抗体针对待测物的特异性至关重要。 半抗原间隔臂的连接位点，最好选择 极性较低且远离半抗原的特征性结 构。如果待测物的极性较高，半抗原 合成的过程中最好保持其与目标待 测物极性的一致性。人工抗原具有较 高的极性，对于引发免疫反应有重要 作用。在结构如图 3 Bentazon 的抗 体制备过程中，有三个介入位点。异 丙基远离杂环，是联入间隔臂的理想 位点，可以最小程度的改变待测物的 物理和化学特性。但异丙基是这物质 的特异性基团，对于保证制备抗体的 特异性很重要，所以不能选择这个位Bentason II 位的亚氨基具有很强 的极性，如果间隔臂联入

7、这个位点极 性将会消失。这种化合物的衍生物大 多为非极性，如果要制备多残留的抗 体，增加交叉反应率，这个位点将是 理想的间隔臂介入位点。但对特异性 要求高的抗体制备，就必须要保证半 抗原的极性，所以对于高特异性的抗 体制备来说，这一位点也不适合连入 间隔臂。在 III 位介入直链的间隔臂， 可以保证与待测物极性的一致，而且 中性的多甲基直链对杂环的电子排 布影响也较小。 试验结果显示 II ，III 联入间隔臂制备的抗体对 Bentason 的灵敏度很差，但是对 II 位氨基衍 生的样品的灵敏度高于目标待测物， 说明衍生物的非极性是灵敏度高于 原 形 Bentason 的 原 因 。 这 也

8、与 MQCA 抗体对原型药物识别能力较 差，但对丁胺衍生后的样品具有高灵 敏度的实验结果相一致。说明半抗原 与待测药物电荷状态的一致性，在这 些极性很强的药物小分子免疫残留 检测方法中要重点考虑。但 III 位接 入间隔臂的人工抗原制备的抗体的 灵敏度与预期不一致，这可能因为再 III 位联入间隔臂时，间隔臂上面自 由的羧酸基团可能与 II 位自由的氨 基发生偶联，所以 III 位联入间隔臂 的人工抗原的极性与目标待测物不 一致，这也是抗体对目标待测物识别 能力较差的原因。在 Eva M. Brun 等（ 2004 ）的实验 中，根据待测物杀螟松的结构设计了 多种半抗原的组合，具有特异性的结

9、构的是用椭圆标记出来的，在连接偶 联臂时就要充分考虑暴露这一重要 的抗原表位，研究中通过对比接入偶 联臂的不同结构的半抗原 （图 4 ），显 示充分暴露该结构的 F7 半抗原制备 人工抗原免疫动物得到的多克隆抗 体，具有最好的灵敏度和效价。 （Eva M. Brun et al ， 2004） 间隔臂的介入位点，最好远离特征性 的基团，而且要尽可能保存特异性较 大的杂原子或带侧链的碳链结构，联 入的间隔臂最好在苯环或其他杂环 的碳原子上，这样可以最大程度的保 证半抗原的极性与目标待测物的一 致性，如果有远离大环的碳链结构， 那么碳链的末端也是一个很好的介 入位点，因为这样的结构对大环的电 子排

10、布影响较小。 (Young Ae Cho et al ，2004 ) 除了间隔臂的接入位点以外，间隔臂 本身的结构也是影响半抗原合成是 否成功的重要因素。虽然半抗原接入 间隔臂是必要的，但间隔臂太长会导 致半抗原分子的折叠，使其更接近载体蛋白，屏蔽作用增强。一些学者认 为理想的间隔臂长度是中度的 3 6 个直链碳原子构成，这时得到抗体的 灵敏度要高于间隔臂很短的人工抗 原制备的抗体（ 6，13 ，20 ，21 ）， 但在另外的试验中，使用零间隔臂的 免疫原也得到了特异性很好的抗体。 在 Yoo Jung Kim 实验中，在间隔臂 介入位点为最佳的时候 （见图 4 ），当 间隔臂的长度在 2 6

11、 之间时，分别 制备了人工抗原，在载体蛋白以及其 他的免疫程序一致的条件下，不同免 疫原产生的抗体在亲和能力和灵敏 度方面都没有明显的差异。也说明在 间隔臂长度适中的情况下，间隔臂的 长度对免疫检测的灵敏度没有明显 的影响。间隔臂的选择，一般间隔臂要求本身 不要产生针对间隔臂的抗体，而且对 半抗原的结构影响要小，并且末端要 含有能与载体蛋白氨基或羧基偶联 的活性基团，一般为氨基，羧基，或 羟基。间隔臂与小分子半抗原连接一 端，最好以单纯的碳链连接，如果难 以实现也要选择电性较低的连接基 团，试验证明以酰胺键相连接，产生 的抗体对间隔臂有很高的亲和系数。 （高爱中 硕士论文 2005 ） 有试验

12、表明当联入的间隔臂末端为 羟基时，产生抗体的灵敏度要明显高 于相同条件下间隔臂以羧酸基团为 末端的人工抗原制备的抗体。这可能 因为含间隔臂半抗原末端不同，所以 与载体蛋白的偶联方式不同，所以含 羟基的半抗原可以提高半抗原与载 体的偶联比，并且能够更好的暴露半 抗原的抗原决定簇。 （Brun et al ， 2004 ） 虽然对于含多个特异性结构的大分 子化合物来说，用含苯环的间隔臂或 零间隔臂同样可能制备处特异性好， 灵敏度高的抗体。但现在很多试验都 证明，选择简单的中长度的碳链对于 半抗原合成是最佳选择，也是小分子 药物半抗原合成选择间隔臂的通用 方法。 用作载体的有蛋白质类、多肽聚合 物、

13、大分子聚合物和某些颗粒，常用 的有明胶、牛血清白蛋白（ BSA ）、 人血清白蛋白（ HSA ）、兔血清白蛋 白、卵清白蛋白（ OVA ）、匙孔血蓝 蛋白（ KLH ）等。选择载体要综合考 虑分子量、活性基团、溶解度及来源， 价格等因素。明胶做为载体免疫原性 差，需要多次免疫。匙孔血蓝蛋白 （KLH ）价格昂贵，虽然免疫原性强， 但它激发的 B 淋巴细胞克隆中针对 自身抗原决定簇的多，相对减少了针 对半抗原的 B 淋巴细胞克隆， 增加阳 性克隆筛选的难度和工作量 ( Fasciglione et al. ， 1996 )。一 般认为，用与免疫动物亲缘关系较远 的蛋白作为载体可能会更好， BSA

14、 与 HSA 都是良好的载体蛋白， 均能刺激 动物产生特异性抗体，并且 BSA 、 HSA 和 OVA 这几种载体分子量适 中、来源容易、价格便宜、水溶性好， 故常用作半抗原载体；此外 BSA 、 HSA 和 OVA 都具有大量的反应基 团，如氨基、羧基等，且能在水相或 某些有机溶剂的混合物中充分溶解， 使偶联反应可在较高浓度的反应物 存在条件下进行，据报道，每分子 BSA 有 60 个游离氨基，每分子 OVA 有 20 个游离氨基( NCBI 蛋白质数据库)可以和合成半抗原的羧基反应 形成肽键，合成免疫原。 由试验表明在单克隆抗体的制备过 程中，脂蛋白 Th 细胞抗原决定基 载体蛋白 (Pa

15、m3Cys-TH) 制备抗体 的灵敏度高于用 BSA ，KLH 作为载 体蛋白制备的抗体，可能因为这种载 体蛋白的支链更长。用 BSA 或 KLH 作为载体制备抗体的亲和力很差，因 为分子在体内很快被肾脏系统消除， 而新载体 Pam3Cys-TH 就克服了这 样 的 问 题 。 (Hoffmann et al. ， 1997; Baier et al.，2000) 。并且Pam3Cys-TH 本身就可以做为佐剂 使用，所以产生的免疫反应非常强，有利于产生高亲和力的抗体。 因为抗原展示细胞 (APC) 表面是带 负电荷的，通常认为如果载体蛋白经 过离子化处理带有正电荷，就更容易 结合到带负电荷的细胞表面，能引起 更强的免疫反应。 (Apple et al. ， 1988)以上仅是个人查文献的一些总结，而 且很多结果都不能从原理上解释清 楚，所以抗体制备的时候最好还是多 考虑几种抗原设计方案。根据初步筛 选的结果确定用哪种抗原免疫的动 物做融合。