蛋白质含量测量—、实验目的1. 学会各种蛋白质含量的测定方法2. 了解各种测定方法的基本原理和优缺点二、实验原理1.考马斯亮兰法（Bradford法）考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的 这种蛋白质测定法具有超过其他的突出优点，因而正在得到广泛的应用这一方 法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法考马斯亮兰G-250染料（如图），在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸 收峰的位置（Amax）,由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为兰色 经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨 基酸残基相结合在595nm下测定的吸光度值A5%，与蛋白质浓度成正比CHjCI^OBradf ord法的突出优点是：（1） 灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1咫 这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质一染料复合物有更高 的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多2） 测定快速、简便，只需加一种试剂完成一个样品的测定，只需要5分钟 左右由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在 1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。
因而完全 不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间3） 干扰物质少如干扰Lowry法的K\ Na\ Mg”离子、Tris缓冲液、糖和蔗 糖、甘油、筑基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法此法的缺点是：（1） 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford 法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用y—球蛋白 为标准蛋白质，以减少这方面的偏差2） 仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 TritonXTOO、十二烷基硫酸钠（SDS）和0. 1N的NaOHo（如同0. 1N的酸干扰Lowary 法一样）3） 标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能 用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度2.紫外吸收法蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轴双键，使蛋白质 具有吸收紫外光的性质吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白 质含量成正比此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比利用 一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质 含量的测定紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。
低浓度 的盐，例如生化制备中常用的（NH.） 2S0，.等和大多数缓冲液不干扰测定特别适 用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不 需知道其绝对值此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法 测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质, 有一定的误差故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质若样 品中含有哽吟、嗟嚏及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰核酸的干 扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正但是因为不同的蛋 白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的 误差此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变 化，因此要注意溶液的pH值，测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致按测定的波长划分，紫外吸收法分为多种，本实验中使用三种：①280nm的光吸收法因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处具有最大吸收，且 各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280nm处的 吸光度值是最常用的紫外吸收法测定时，将待测蛋白质溶液倒入石英比色.皿中，用配制蛋白质溶液的溶剂（水 或缓冲液）作空白对照，在紫外分光度计上直接读取280nm的吸光度值A”。
蛋 白质浓度可控制在0. ri. Omg/ml左右通常用lcm光径的标准石英比色皿，盛 有浓度为Img/ml的蛋白质溶液时，A*约为1.0左右由此可立即计算出蛋白质 的大致浓度许多蛋白质在一定浓度和一定波长下的光吸收值（A气5）有文献数据可查， 根据此光吸收值可以较准确地计算蛋白质浓度下式列出了蛋白质浓度与（Ax\.）值（即蛋白质溶液浓度为1%,光径为1cm时的光吸收值）的关系文献值A气g "尔为百分吸收系数或比吸收系数蛋白质浓度=（MoxlO ） /A1 1cm, 280am （mg/ml）（因为：1% 浓度 «10mg/ml）本实验中用的是牛血清清蛋白：AJ6.3 （280nm）若查不到待测蛋白质的AZs值，则可选用一种与待测蛋白质的酪氨酸和色 氨酸含量相近的蛋白质作为标准蛋白质，用标准曲线法进行测定标准蛋白质溶 液配制的浓度为1.0mg/ml常用的标准蛋白质为牛血清清蛋白（BSA）标准曲线的测定：取6支试管，按下表编号并加入试剂：用第1管为空白对照，各管溶液混匀后在紫外分光光度计上测定吸光度A” 以A湖为纵座标，各管的蛋白质浓度或蛋白质量（mg）为横座标作图，标准曲线 应为直线，利用此标准曲线，根据测出的未知样品的冬8。
值，即可查出未知样品 的蛋白质含量，也可以用2至6管&8值与相应的试管中的蛋白质浓度计算出该 蛋白质的A气心顾②215nm与225nm的吸收差法蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收测定时，可用215nm与 225nm吸收值之差，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度用己知浓度的标准蛋白质，配制成20〜lOOpg/ml的一系列5. Oml的蛋白质溶液， 分别测定215nm和225nm的吸光度值，并计算出吸收差：吸收差 A215 —A225以吸收差△为纵座标，蛋白质浓度为横座标，绘出标准曲线再测出未知样 品的吸收差，即可由标准曲线上查出未知样品的蛋白质浓度本方法在蛋白质浓度20~100pg/m 1范围内，蛋白质浓度与吸光度成正比， NaCK （阻）2SO1以及0. 1M磷酸、硼酸和Tris等缓冲液，都无显著干扰作用， 但是0. IN NaOH, 0. 1M乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、巴比妥等缓冲液的215nm 光吸收值较大，必须将其浓度降到0. 005M以下才无显著影响三、仪器与试剂1. 考马斯亮蓝法：1. 试剂：（1） 标准蛋白质溶液,用牛血清清蛋白（BSA）,配制成1. Omg/ml和0. lmg/ml 的标准蛋白质溶液。
2） 考马斯亮兰G—250染料试剂:称lOOmg考马斯亮兰G—250,溶于50ml95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升2. 器材：（1） 可见光分光光度计（2） 旋涡混合器（3） 试管16支2. 紫外吸收法：1・试剂:标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA）,配制成1. Omg/ml和 0. lmg/ml的标准蛋白质溶液2.器材：（1） 紫外分光光度计（2） 旋涡混合器（3） 试管11支四、实验步骤（-）.考马斯亮蓝法：1. 标准方法（1） 取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按 表1中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1. Omg/m 1的标准蛋白质溶液给各 试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0. 1ml,然后用无离子水补 充到0. 1mlo最后各试管中分别加入5. Oml考马斯亮蓝G—250试剂，每加完一 管，立即在旋涡混合器上混合未知样品的加样量见表1中的第8、9、10管2） 加完试剂2~5分钟后，开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在 595nm处的光吸收值A595,空白对照为第1号试管,即0. lmlH20加5. OmlG—250 试剂。
3） 用标准蛋白质量（皿）为横座标，用吸光度值A%,为纵座标，作图，即 得到一条标准曲线由此标准曲线，根据测出的未知样品的冬95值，即可查出未 知样品的蛋白质含量2. 微量法当样品中蛋白质浓度较稀时（10-100^/ml），可将取样量（包括补加的水） 加大到0. 5ml或1. Oml,空白对照则分别为0. 5m 1或1. Oml压0,考马斯亮蓝G -250试剂仍加5. Oml,同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值紫外吸收法（1） 取6〜11支试管，1支作空白，其余试管按表2.3.4中剂量，分别加入 样品和水加完后，在旋涡混合器上混合2） 加完试剂2〜5分钟后，开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在 表中指定波长处的光吸收值，空白对照为第1号试管，即纯水3） 用标准蛋白质量（心）为横座标，用吸光度值为纵座标，作图，即得 到一条标准曲线该方法不要求测未知4) 加量步骤，在1到6号试管中依次加入标准蛋白(lmg/mL)体积0.0、 0.4、0.6、0.8、1.2、1.6、2. 0ml, 7号试管中加入2. OmL待测蛋白溶液,再加 入去离子水将体积补充至2. 0ml o(5) 操作流程图如下：取试管，标号按表格依次加入蛋白质，水和考马斯亮蓝(紫外吸收法不用)测定所需的分光光度值六、实验结果：数据及处理(_).考马斯亮蓝微量法：1. 标准数据表记录表1考马斯亮蓝法常量法数据(加样单位：ml)管号 12345 6 7 8 9 10标准蛋白质/mL (0. 1 mg/ml)00. 10.20.40. 60. 81. 0未知蛋白质(mL)0. 050. 10.2蒸馅水(mL)1.00. 90.80. 60.40. 200. 950. 90.8蛋白质浓度 (mg/mL)00. 010. 020. 040. 060. 080. 10考马斯亮蓝G-250 试剂(M)333333333每管中的蛋白质 质量(昭)01020406080100光吸收值J)0. 000. 0520. 0930. 1700. 2190. 2640.3230. 1360. 2380. 3290. 000. 0620. 1140. 1590. 2400.2560.3180. 1310. 2340. 317平均值“595)0. 000. 0570. 1040. 1650. 2300.2600.3210. 1340. 2360. 3232. 数据处理与图像拟合根据表中的两组标准蛋白吸光度的平均值进行二次曲线拟和，得到标准曲 线如下(/?2二0.9933)：标准蛋白■光度吸收关系图(S6S<旦坚密呆0.1340.250.4470.5620.344y = -0.065x2 + 0.614x + 0.006 R J0.9980.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2标准蛋白浓度(mg/mL)将未知蛋白的吸光度代入计算，分别得到8、9、10组的蛋白质浓度，依次 为：C] = 0.032 mg/mL。
2 = 0.065 mg/mLC3 = 0.108 mg/mL根据稀释的倍数，可得到待测蛋。