常见的PCR添加剂

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1、PCR添加剂是PCR反应中的一种增效剂，它们在PCR反应中起到提高PCR反应的特异性、增加PCR扩增的产量及防止无效扩增等有益效果。由于PCR 技术在有些情况下扩增的不完美性，从PCR技术发明的初期开始，人们就展 开了对PCR反应中添加其它化学物质的研究。迄今为止，在PCR添加剂的 研究领域，人们已经发现了越来越多的PCR添加剂，它们都以各自的特性在 不同的方面对PCR反应起着促进作用。而随着PCR添加剂研究的不断发展， 在各种相关研究中，人们逐渐从研究和应用单一型PCR添加剂转向研究和应 用复合型PCR添加剂，从传统PCR添加剂的研究开发转向新材料新化合物 PCR添加剂的研究开发。传统的PC

2、R添加剂包括常见的助溶剂、离子化和非离子化的除垢剂以及一些 诸如氯化四甲基铵（TMAC）、甜菜碱、SSB等。多年来人们对这些添加剂 的研究表明，它们在一定的浓度范围内对某些PCR有着增效作用，但在另外 一些情况下或在其它的浓度范围内对PCR反应又有着抑制作用，所以这些 PCR添加剂的在不同反应体系中的应用应通过试验来调整和合理选择，合理 准确的使用会使PCR反应获得很大的改善，从而得到试验所需要的理想结 果。甜菜碱是一种高效的甲基受体，它在一些细菌体内对抵抗因盐份引起的渗透 压升高起着重要的作用，其做为一种PCR添加剂，出现在Rees.W.A.22等 人对甜菜碱降低DNA的Tm所做的研究之后。

3、甜菜碱广泛存在于多种酶以及 PCR试剂盒中，它能提高PCR扩增的效率和特异性，特别是在长 PCR （Long-PCR）扩增时常被应用23。Barnes23指出，在Long-PCR中添 加甜菜碱能够使每个循环的热变性温度下降到92C93C，且退火温度也可 以下降1C2C,从而补偿因退火条件变化及因其它添加剂引起的酶稳定性 下降引起的PCR反应的负面效果。另外，他还指出甜菜碱不仅能促进高GC 含量片段的扩增，而且能提高普通的PCR扩增的目的产物量24。甜菜碱另 外一个优点是，作为一种渗透保护剂，它具有和牛血清白蛋白（BSA）类似 的功能，能够防止聚合酶的变性24。把Long-PCR Buffer中

4、的BSA换成 甜菜碱将有利于减少弥散问题的发生。甜菜碱也有可以克服DNA少量污染带 来的扩增困难，这意味着PCR反应可以在低质量模板存在的情况下进行25。 氯化四甲基铵（TMAC）最早被用于在杂交反应中减少DNA / RNA的错配以 提高特异性26，在PCR反应中，它能够增加PCR反应的效率和提高PCR 反应的特异性。在Ted Hung等人27首次发现TMAC提高PCR反应特异性 的研究中，他们选择了两个mouse cDNA的基因片段进行扩增实验。结果显 示，含有1x10-51x10-4M TMAC的实验组扩增结果在电泳图上只出现一条 单一的目的条带，而未含有TMAC的实验组特异性非常差，有多

5、条非目的条 带出现。Eric Chevet等人28在研究中还发现，通过添加TMAC可以提高AT 含量丰富的DNA片段的Tm，从而通过改善引物的特异性结合来提高PCR 反应的特异性。在研究中，他们实验了不同浓度的TMAC促进PCR反应的 效果，发现TMAC的最佳添加浓度为60mM。他们的研究还表明，TMAC不 仅可以提高PCR反应的特异性，而且可以提高PCR反应的效率，三对引物 的扩增实验均发现添加TMAC可以提高PCR目的产物产量510倍。单链结合蛋白（SSB）是活的生物体中不可缺少的重要物质，它非特异性的 和单链DNA结合，参与所有涉及到单链DNA的诸如复制，修复及重组等过 程29。这种体内

6、DNA复制过程中SSB所起到的重要作用，自然引起了人们 对SSB在PCR这一体外DNA复制技术中应用的可行性考虑。Rapley等人 30在 1994年首次就SSB在PCR中的应用做了专门研究。他们研究发现 T4噬菌体基因32编码蛋白及大肠杆菌单链结合蛋白对数种模板的PCR反应 均有提高效率的作用。由于PCR反应是一个不断的热循环过程，因此嗜热源 SSB是PCR添加剂的理想来源，这一点在近年来的研究中得到了证实。Dbrowski 等12就曾克隆 Thermus aquaticus 和 T.thermophilus 的 SSB 编 码基因并让它们在E. coli中过表达，随后进行的Taq SSB及

7、Th SSB在PCR 中的添加实验表明它们均能很好的提高PCR反应效率。之后不久，Perales 等人13表达纯化了三种类型ThSSB，在Th聚合酶和Pfu聚合酶的PCR体 系中所做的实验发现ThSSB可以使PCR延伸的时间减半，而且在无校正功 能的Th聚合酶PCR体系中的实验进一步表明ThSSB可以增加PCR反应的 保真度。而Olszewski等人14在multiplex PCR实验中对TaqSSB的研究 发现其可以防止或减少引物二聚体的形成，从而有效提高PCR反应的效率和 特异性。甲酰胺(Formamide)是被较早发现并广泛应用的PCR添加剂之一，它能显 著性的提高PCR反应的特异性8。

8、为了开发新的更高效的PCR增效剂，Raj Charabarti等人31对与甲酰胺结构类似的低分子量的胺类化合物在PCR中 的应用做了专门的研究。在Raj Charabarti等人的研究中，包括甲酰胺在内 的与甲酰胺结构类似的共四大类10种低分子量胺类化合物做了 PCR反应添 加实验。实验结果表明，acetamide对中等GC含量的片段扩增有非常好的 效果，而对高GC含量的片段却并不是这样；2-pyrolidone对多数基因片段都 有特别好的增强扩增的效果，特别是在高GC含量的扩增中表现出很好的效 果。DMSO是也是一种较早被发现的且广泛应用的PCR增效剂P.R.Winship5、 B.Bach

9、mann32等较早对DMSO在PCR产物测序中能有效降低DNA链的 复性做过报道，随后 D. Pomp33，G. Sarkar8, Filichkin.S.A.34及 Sun Y35 等人对DMSO在PCR中的应用做了进一步的研究，虽然他们的报道中都指 出DMSO能够全部或部分的提高PCR反应的特异性，但各自报道的有效作 用浓度都有很大差别，添加量从0.9%到15%不等，过高浓度的DMSO均能 抑制PCR反应。肖志壮36等人就过量DMSO抑制PCR反应及降低PCR 扩增的特异性的现象在所实验的PCR模型上做过专门的研究并提出了应对 的策略，他们的研究表明，在10 %DMSO的反应体系中，引物浓

10、度为7. 5 x10 -7mol/ L时，模板浓度提高到1.6x10 - 10mol/ L即可完全避免非特异扩增。 值得注意的是，10 %DMSO存在时，如果引物浓度降低至7. 5 x10 - 8mol/ L， 则看不到特异产物，也就是说，反应体系含DMSO时，需增加引物浓度，保 证PCR特异扩增。因此，DMSO用于PCR时一定要注意平衡模板、引物及 DMSO的浓度，这一点值得我们在应用DMSO的PCR实验中加以注意。鉴于DMSO在优化PCR反应中所起的效果且同样为了开发新的更高效的 PCR添加剂，Raj Charabarti等人37还对其它几种水溶性亚砜类化合物在 PCR中的应用做了相应的研

11、究，以期判断它们是否也具有同样的优化PCR 反应的效果。在实验中，他们选用了三种高GC模板PCR模型，就DMSO、 methyl sec-butyl sulfoxide, n-propyl sulfoxide, n-butyl sulfoxide, and tetramethylene sulfoxide等五种亚砜类化合物优化PCR反应的分别做了测 试。在这五种测试的亚砜类化合物中，methyl sec-butyl sulfoxide为唯一一种 分子结构呈不对称性的化合物，tetramethylene sulfoxide为唯一一种分子结构含环形功能团的化合物。在三种高GC模板模型中，牛脑GTP

12、 cDNA(660bp,58%GC)模板为主要受测模型，所有五种亚砜类化合物首先在这个模型上进行测试。结果表明，除添加n-butyl sulfoxide的实验组未出现任何目的产物外， 其它四种被测化合物均有表现出很强的提高PCR反应特异性的效果，且对应 得到目的产物均有很高的产量。具体效果效果为：tetramethylene sulfoxide 为效果最佳，methyl sec-butyl sulfoxide 次之，接下来是 n-propyl sulfoxide， DMSO以其只能获得所有产物中89%的特异性产物而居最后。在产量上，添 加 tetramethylene sulfoxide，me

13、thyl sec-butyl sulfoxide 及 n-propyl sulfoxide 后的实验组为添加DMSO实验组的23倍多。而在接下的来实验中，对剩 下四种化合物，同样以牛脑GTP cDNA (660bp, 58%GC )模板为模型实验 了的各种化合物的有效作用浓度范围，实验结果表明，tetramethylenesulfoxide 的有效作用浓度范围为：0.281.0M，methyl sec-butyl sulfoxide 的有效作用浓度范围为：0.030.31M，n-propyl sulfoxide的有效作用浓度 范围为：0.150.36M，DMSO的有效作用浓度范围为：0.751

14、.25M。在 996bp人骨髓白细胞c-jun cDNA ( 64%GC)模型上所做的进一步测试表明， 变性温度为95C时，tetramethylene sulfoxide相比于DMSO有较好的作用 效果，而propyl sulfoxide相比于DMSO则效果较差；变性温度为92C时， tetramethylene sulfoxide则为唯一有效的添加剂。而在511bp人PSMcDNA(52%GC, 158bp 73% GC片段)模型上的测试再一次证明 tetramethylene sulfoxide 为最有效的添加剂，DMSO 次之，propyl sulfoxide 居最后。和作者稍早前基于

15、相同的出发点对系列砜类化合物作为PCR添加剂 所做研究的结果对比分析可知38，虽然methyl sulfone比DMSO的效果稍 好，但亚砜类化合物总体来说作用效果要好于砜类化合物。作者进一步的比 较分析指出，这种在PCR反应中不同亚砜类化合物间所表现出的不同效果是 有一定的化学式上的结构依赖性的，同比来说环状结构的砜类、亚砜类及胺 类化合物作用效果明显优于其它结构的化合物。有研究者认为DMSO提高 PCR反应的特异性是由于其于模板DNA的大沟和小沟结合并破坏其双链结 构，在这里，作者认为环状结构化合物的独特作用效果可能是由于其破坏了 模板DNA大沟和小沟里带有供体和受体互补氢键的理想构象，也

16、有可能其通 过限制DNA链的自由旋转而使得DNA骨架的相邻基团间位间排斥减小。新型高效是以上从结构类似化合物中筛选新PCR添加剂的出发点，近年来， 复合型PCR添加剂的开发更是朝这各目标又迈进了一步。所谓的复合型添加 剂就是把两种或两种以上的PCR添加剂通过一定的比例混合在一起形成的 新型PCR添加剂，和单一 PCR添加剂相比，其促进PCR的效率更高。N. Baskaran等人39的报道中，实验了四种不同的片段的PCR，其中两个高 GC片段（64%和80%），两个非高GC片段（44%和52%）。当在同一个 体系中同时扩增四个片段时，实验表明1.0M的甜菜碱结合6%8%DMSO 及5%DMSO结合1.21.8M的甜菜碱能很好的同时扩增出四种目的片段， 虽然高浓度的DMSO及高浓度的甜菜碱在也能扩增出某种或某几种片段，但 四种目的片段的产量均衡性比不上甜菜碱和DMSO组成的复合型添加剂。最 近，J