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1、Y(Bx)x实验二酵母菌种子液的制备 -实验目的（1）了解酵母菌活化方法（2）了解果汁的简单制作（3）明确血球计数板计数的原理（4）掌握测定酵母细胞总数、出芽率和死 亡率的方法二实验原理酵母菌通过乙醇发酵将水果原料中可发酵的糖 转化为乙醇，酵母菌种子液的制备及种子液质量对 发酵至关重要。酵母细胞总数、出芽率和死亡率的 测定是衡量酵母菌种子液的质量指标之一。三实验材料及设备酿酒酵母；苹果；白砂糖；手持糖度仪；电磁炉； 榨汁机；血球计数板；显微镜四试验步骤1果汁（酵母活化培养基）的制备（1）选料：原料要求新鲜，无病虫害，八成熟 以上为宜（2）去皮、核：苹果的果皮和果核带有苦味， 且果核较小坚硬，在
2、破碎打浆时容易被破碎而进入 果浆，使酒产生不良风味，故应去除。（3）打浆（每组制作两部分：1.5L用于酿酒的 果浆和50mL活化酵母菌的果汁）：用于酿果酒的 1.5L的果浆制备：苹果富含多酚氧化酶，为抑制杂 菌繁殖和酶促褐变与非酶促褐变的发生，打浆时添 加偏重亚硫酸钠护色，并帮助澄清。添加量为破碎 果实重量的0.15%，将果实切碎，按照果实碎块： 水=1:1的比例添加水（榨出的果浆大概为水体积的 两倍），使果肉充分打成糊状，即充分破坏果肉组织，使其中的可溶性物质能从果肉细胞中游离出来（榨出的果肉不用纱布过滤），之后放入2.5L发酵 瓶中各1.5L。用于活化酵母菌的果汁培养基250ml （供6组
3、用）： 按照果实碎块：水=2:1的比例添加水（过滤出的果 汁大约为加入水的两倍），使果肉充分打成糊状， 即充分破坏果肉组织，用三层纱布将汁液过滤入烧 杯中。（4）接种酵母菌：将烧杯中的果汁培养基加热 至沸腾灭菌，分装入6个100mL的锥形瓶中各 40mL，待温度冷却到30C左右时，将斜面上酵母 菌挑取接入40mL果汁中，摇匀后用锡纸封上瓶口 置于28C生化培养箱中过夜培养。（5）加果胶酶（加入到装有1.5L果浆的发酵 瓶中）：苹果中含有果胶，打浆后黏度大，流动性 差，加入果胶酶可使浆液中的可溶性固形物增加， 提高出汁率，果胶酶的添加量为100mL添加0.06g， 常温下酶解24h。（6）调整成
4、分（第二天1.5L果汁澄清过滤后调 整）：1.7g的糖可以发酵成1的酒，要酿成12的苹 果酒，必须保证果汁中糖的浓度为22Bx左右，而 苹果汁中糖的浓度约为7%左右，所以添加蔗糖调 节可溶性固形物至22%左右加糖量1.7 x 12 x X (果汁体积)(g)=100X （果汁体积）10（7）加入活化后酵母菌液：每组将活化24h的40mL酵母菌悬液直接加入1.5L经过澄清过滤并调整过成分的果汁中。细胞数/mL=(100小格内的细胞数/100) X400X2酵母菌活性测定2.1出芽率和死亡率测定分别滴加一滴0.1%的吕氏碱性美蓝和酵母菌 种子液在载玻片上混合，放置10min在显微镜下观 察酵母菌，
5、选择两三个视野取平均值，测酵母菌的 死亡率和出芽率，酵母菌自身的氧化还原性能把美 蓝还原为无色，而死细胞则没有还原性。2.2酵母菌总数测定(1) 镜检计数室：在加样前，先对计数板的计数 室进行镜检。若有污物，则需清洗后才能进行计数(2) 加样品：将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻 片，再用无菌的细口滴管将酵母菌液由盖玻片边缘 滴一小滴(不宜过多)，使菌液沿缝隙靠毛细渗透 作用自行进入计数室，一般计数室均能充满菌液。 注意不可有气泡产生。静置510分钟即可计数。(3) 显微镜计数：将血球计数板置于显微镜载物 台上，先用10倍物镜找到计数室所在位置，然后 换成40倍物镜进行计数。在计数前若发现菌液太
6、浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品 稀释度要求每小格内约有510个菌体为宜，若选 用16X25规格的计数板，则数四个角：左上、右 上、左下、右下的四个中方格，(即100小格)中 的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方 和右边线上的。25X16的计数板计算公式：细胞数/mL=(80小格内的细胞数/80) X 400 X 10000 X稀释倍数=A/5 X 25 X 104 XB16X25的计数板计算公式：10000 X稀释倍数=A/4 X16 X104 XB五注意事项(1) 配制适当浓度的酵母菌悬液，保证血球计 数板中的每小格中有5-10个酵母菌(2) 调节显微镜光线的强弱适当，
7、对于用反光 镜采光的显微镜还要注意光线不要偏向一边，否则 视野中不易看清楚计数室方格线，或只见竖线或只 见横线。(3) 血球计数板使用后，用自来水冲洗，切勿 用硬物洗刷，洗后自行晾干(4) 如果酵母菌的芽体大小达到母细胞的一半 时，即作两个菌体计数。计数一个样品要从两个计 数室中计得的值来计算样品的含菌量。实验三苹果酒的酿制1实验目的了解果酒的制作原理，学习果酒的制作工艺。2实验原理果酒酿造是利用酵母菌将果汁中的糖分经酒精 发酵转变为酒精等产物，再在陈酿、澄清过程中经 酯化、氧化及沉淀等作用，使之成为酒质澄清、色 泽美观、醇和芳香的产品。果酒酿造要经历酒精发 酵和陈酿等两个阶段。在这两个阶段中
8、发生着不同 的生物化学反应，对果汁的质量起着不同的作用。3实验材料及设备酿酒酵母；苹果；偏重亚硫酸钠；白砂糖；果胶 酶手持糖度仪；电炉；榨汁机；数显电热恒温水菌接入，摇动果汁使之分散。在28C培养48h即为浴锅；pH计酵母菌种子液。4实验过程(7)主发酵：发酵温度为1825C发酵2d后，1工艺流程表面产出泡沫，并形成一层由果肉碎屑、蛋白质、原料挑选清洗去皮、核破碎打浆果胶等物质组成的泡盖，当泡盖开始下沉面逐加果胶酶 过滤调整成分加热消毒一渐澄清，说明发酵速度变缓f发酵结束。这一阶接种酵f发酵后发酵过滤陈 酿澄清调配冷处理2操作要点(1) 选料：原料要求新鲜，无病虫害，八成熟 以上为宜(2) 去
9、皮、核：苹果的果皮和果核带有苦味， 且果核较小坚硬，在破碎打浆时容易被破碎而进入 果浆，使酒产生不良风味，故应去除。(3) 打浆：苹果果肉不仅含有丰富的糖类、蛋 白质、氨基酸等营养物质，还富含多酚氧化酶，为 抑制杂菌繁殖和酶促褐变与非酶促褐变的发生，打 浆时添加偏重亚硫酸钠护色，添加量为破碎果实的 0.15%,(4) 加果胶酶：苹果中含有果胶，打浆后黏度 大，流动性差，需加水进行稀释，果浆：水=2:1， 加入果胶酶可使浆液中的可溶性固形物增加，提高 出汁率，果胶酶的添加量为0.06%，酶解温度为 50C，酶解时间为2h。(5) 调整成分：要发酵成酒精含量为12%(v/v) 的果酒，需要果汁含糖
10、量为17%22%，因此应添 加蔗糖调节可溶性糖含量至22%，使酵母菌适宜生 长。(6) 酵母菌活化：将制备好的果汁煮沸，装入 段1215d。在主发酵过程注意控制醪液温度在 30C以下，保证发酵正常进行。(8) 后发酵：将上层发酵液转入新发酵罐中继 续发酵，酵母菌仍对残糖进行缓慢发酵，控制后发 酵温度为2025C经过1520d后，发酵基本停 止，发酵醪中颗粒物质凝聚沉淀下来。(9) 陈酿：发酵完毕的酒液分离出酒糟，将酒 液放在1825C下保存90d，通过酒液自身氧化还 原、聚合沉淀等反应，减少酒中不良风味物质，促 使蛋白质、果胶、单宁等物质析出，使得酒味更加 香醇。(10) 澄清：将陈酿完的酒液用适量的澄清剂进 行澄清过滤(11) 调配：检测糖度、酸度和酒精度，参照其 他果酒标准调配酒液，适当添加白砂糖、柠檬酸等， 从而提高成酒品质。洁净且灭菌过的三角瓶内。冷却后将斜面上的酵母
