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1、耒縈*辜科类理工类编号（学号）2010312203本科生论文（设计）葡萄籽提取物（GSE）有效成分的分析弓长之千指导教师：邓维萍 职称讲师云南农业大学基信学院化学系650201学 院：基础与信息工程学院专 业： 年级：2010级论文（设计）提交日期：2012年12月10日 答辩日期:答辩委员会主任：云南农业大学2012年12月葡萄籽提取物(GSE)有效成分的分析张之千云南农业大学基础与信息工程学院，昆明650201摘要：葡萄籽提取物(GSE)的多酚化合物包括原花青素和单体多酚， 因此，采用Folin-Ciocal teu法测定葡萄籽提取物总多酚的质量分数, 高效液相色谱法测定单体多酚质量分数,
2、以总多酚质量分数减去单体 多酚质量分数，即可代表样品中原花青素的质量分数则定结果表明， 自制GSE总多酚质量分数稍高于对照样品(天津尖峰天然产物研究开 发公司产品)，分别为90. 5和88. 3 ；没食子酸、儿茶素质量分数 明显高于对照样品；而表儿茶素和表儿茶素没食子酸酯的质量分数稍 低于对照样品。自制样品与对照样品的原花青素质量分数无显著差 异，分别为74. 6和75. 8。关键词：GSE； Folin-Ciocalteu法；HPLC；多酚；原花青素Analysis of Active Compounds in Grape Seeds Extracts(GSE)Abstract： As th
3、e polyphenols of the Grape Seeds Extracts(GSE)contains proanthocyanidins andmononeric phenols , the difference between total amount of polyphenols(TAPP)and monomericphenols(TAMP) could represent the content of proanthocyanidins (CP) in GSE In thismanuscript, TAPP of GSE was determined by the Folin-C
4、iocalteumethod, expressed as Gallic Acid Equivalents, and TAMP determined by HPLC. The concentration of TAPP in GSE samplewhich made by this study was 90 5 , was higher 2. 4 than that of the control(88. 3 , Jianfeng GSE, Tianjin). For the TAMP case, the content of gallic acid and catechin were highe
5、r, but the content of epicatechin and epicatechin gallate were lower than that of the cont ro1. ForCP, no significa nt difference bet ween the tWO GSEs sample was detected, was 74. 6 and75. 8 , respectivelyKey words： GSE； Folin-Ciocalteu； HPLC； polyphenols； proanthocyanidins葡萄籽提取物(GSE)有效成分的分析1前言葡萄籽提
6、取物(Grape Seed Extract, GSE)是从酿酒葡萄的种子中提取出来 的一种多酚物质混合物叫，其中的原花青素具有极强的抗氧化性s-,是一种极 强的体内活性功能因子。但由于GSE产品成分复杂，对其原花青素质量分数，目 前尚无统一的检测方法。而GSE包含单体多酚和聚合多酚。GSE中单体多酚的质量 分数一般在10. O左右，主要包括没食子酸、儿茶素、表儿茶素和表儿茶素没食 子酯，这4种单体的质量分数占到了GSE中单体多酚总量的90. 0%以上2。聚合 多酚则包括由以上单体聚合而成的原花青素。原花青素是葡萄籽中最主要的多酚 类物质，质量分数一般为7585 1。因此，可用测定GSE总多酚和
7、以没食子酸、 儿茶素、表儿茶素和表儿茶素及没食子酸酯质量分数之和的方法来间接测定GSE 中原花青素的质量分数。因此，可用测定GSE总多酚和以没食子酸、儿茶素、表儿茶素和表儿茶素及 没食子酸酯质量分数之和的方法来间接测定GSE中原花青素的质量分数。作者以 市售GES为对照，用改良的Folin-Ciocal teu法定量测定以没食子酸计的总多酚 的质量分数，HPLC法定量测定包括没食子酸、儿茶素、表儿茶素及表儿茶素没子 酸酯在内的单体多酚的总量，GSE中原花色素质量分数即为用改良的 Folin-Ciocal teu法测定的总多酚质量分数与用HPLC法测定的单体多酚总量之的 方法，测定了采用优化工艺
8、制备、冷冻干燥、真空包装的GSE中原花青素的质量 分数。2材料与方法2. 1主要仪器和试剂Shimadzu高效液相色谱仪，色谱柱C s(VP0DS)(250 mm X 4。6 mm ， 5儿m)， b(VPODS)Cl8保护柱；紫外分光光度计。自制葡萄籽提取物干粉，对照葡萄籽 提取物干粉(天津尖峰天然产物研究开发公司产品)。没食子酸、(+) 儿茶素、 (+) 一表儿茶素及(一) 一表儿茶素没食子酸酯标准样品均购自美国Sigma公司。 稳定液：取0。25 g抗坏血酸置于1 L容量瓶中，加约500 mL水，混合，溶解抗坏 血酸。加入100mL乙腈，用水稀释至刻度。标准工作液：精确称取15 mg没食
9、子酸、15 mg儿茶素、20 mg表儿茶素、10 mg表儿茶素没食子酸酯，置 于50 mL容量瓶中，加入40 mL稳定液。超声波降解直至完全溶解。用稳定液稀释 至刻度，得到标准贮备液。标准贮备液用稳定液稀释1： 2，1： 5，1： 10，1： 25, 1： 5O倍，得到标准工作液。样品溶液和空白溶液：称取0. 5 g GSE于50mL容量 瓶中。加入约25 mL5560C的热水，超声溶解30 min。冷却至室温，加5 mL乙 腈，用水稀释至刻度。移液管吸取2mL，移至1OmL容量瓶中。用稳定液稀释至刻 度。0. 45 m膜过滤，待用。除不加入提取物样品外，空白溶液的制备步骤与样 品制备相同。2
10、2实验方法2. 2. 1 Folin-Ciocalteu法测定GSE中的总多酚称取0. 500 g没食子酸，用水溶 解，定容至100 mL,以此母液配制质量浓度为0, 50，100，150，250，500 mg/L的溶液。取6支容量瓶，分别吸取上述溶液1mL，各加水20 mL，福林一肖卡 试剂5 mL，混匀，30 S，8 min内各加入20碳酸钠溶液15 mL，混合后用水定容。 上述溶液在2OC下放置2 h，然后用分光光度计测定各溶液在765 nm下吸光值6。 处理数据，建立标准曲线。称取0。2 g样品，置于5O mL容量瓶中，加入约25 mL蒸馏水，超声溶解5 min，加水稀释至刻度，Fol
11、inCiocalteu法测定吸光 度，并计算多酚纯度。2. 2. 2 HPLC法测定GSE中的4种单体 色谱条件：UV检测器波长280 nm，流速1 mL / min，上样量1O L，柱温3OC。流动相： A2乙酸、9乙腈水溶液，一8O乙腈水溶液;梯度模式：0min 10o0min-25.0 min35。0min40. 0min60. 0min，溶液A相应浓度梯度为 100 1O0 68一68 一1O0 一1O0。注入空白溶液及标准样品溶液，根据数据建立没食子酸、 儿茶素、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯的线性曲线。注入样品溶液，并根据各 自的线性曲线，用下式进行计算。单体质量分数(9, 5)一
12、X1O0式中：c为通过线性回归分析测定的单体质量浓度(mg/mL)；、，r为样品制备液的 终体积(mL) ； d为样品的稀释倍数；7. U为样品的质量(mg)。3结果与讨论3. 1 GSE总多酚的质量分数标准曲线为 一 714。690x(其中Y为浓度，X为吸光度，R 一 0 . 995)。经 Folin-Ciocalteu法测定，自制葡萄籽提取物干粉中总多酚质量分数为9O. 5 (以 没食子酸计)，对照葡萄籽提取物干粉为88. 3 9, 6(以没食子酸计)。3. 2 GSE中的4种单体及原花青素的质量分数参考INA提供的出峰顺序的相关信息及空白实验结果，可判断图2中保留时间为 3. 296mi
13、n的第一个锐锋为配制样品的稳定剂中的成分(抗坏血酸)，后面4个锐锋 依次为没食子酸、儿茶素、表儿茶素和表儿茶素没食子酸酯。它们的保留时间依 次为4。786，12. 755，21. 576，27。112 min。以浓度c对峰面积A进行回归， 所得4种单体的标准曲线见表1。4种单体的进样量分别在0. 061. 4/. tg、0. 061. 3 /. tg、0. 071.7 /. tg、0. 040. 8g范围内线性关系良好。4结论自制GSE中总多酚质量分数为90. 5，稍高于对照的88. 3。没食子酸质量 分数是对照的200多倍，儿茶素质量分数明显高于对照，而表儿茶素和表儿茶素 没食子酸酯的质量分
14、数稍低于对照；原花青素的质量分数，自制GSE与对照的原 花青素质量分数相差不大，分别为74. 6和75. 8。5参考文献：表2两种葡萄籽提取物各成分质量分数Tab. 2 Composition content of these two grape seed extracts%13邵云东，胡光祥，於洪建，等.葡萄籽的质量评价J.中草药，2001，32(11)： 1044 1046.2 冯建光.葡萄籽提取物的质量评定J.中国食品添加剂，2004, 2： 4951.3 Negro C， Tommasi L， Miceli A. Phenolic compounds and antioxidant a
15、ctivity from red grape marc extractsJ. BioresourceTechnology， 2003， 87(1): 41一44.4 凌智群，张晓辉，谢笔钧，等.原花青素的药理学研究进展J.中国药理学通报，2002, 18(1)： 912.5 Pierre L Teissedre， Edwin N Frankel， Andrew L Waterhouse, et a1. Inhibition of in vitro human LDL oxidation by pheno1.ic antioxidants from grapes and winesJ. J Sc
16、i Food Agric， 1996， 70： 55一61.6 王华.葡萄与葡萄酒实验室技术操作规范M.西安：西安地图出版社，1999.致谢：经过一个学期的努力，终于完成了这一论文。作为一个本科生的论文设计，由于以前没 有这方面的经验，先天就有许多不足，如果没有老师的督促指导，以及一起工作的同学们的 支持，想要完成这个论文是相当艰难的。在这里首先要感谢我的老师邓维平老师。在我做论文前做了个PPT,老师在那里给我 纠正了很多错误的地方，并悉心给我指导。除了敬佩老师的专业水平外，她的治学严谨和科 学研究的精神也永远是我学习的榜样，并将积极影响我日后的学习和工作。其次要感谢大学两年多来所有化学系的老师，为我打下了专业知识
