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1、中药炮制实验研究设计炮制因素对甘草中有效成分甘草苷和甘草酸的影响院系药学院班级2012级中药学（专升本）班姓名周雪学号2012129048河南中医学院二零一三年六月炮制因素对甘草中有效成分甘草苷和甘草酸的影响(河南中医学院，郑州，450046)摘要目的：探讨炮制因素对甘草中甘草昔和甘草酸含量的影响。方法：筛选适 当提取方法，采用HPLC-DAD技术，ZorbaxSB-C18 ODS反向色谱柱(4.6 mmx250 mm，5网)，以0.1%(体积分数)甲酸溶液和甲醇为流动相，梯度洗脱，流速1.0 ml-min-1，柱温30C，检测波长250 nm和276 nm。测定了同一产地、同一批次 的甘草和
2、炙甘草中甘草昔和甘草酸的含量。结果：甘草经蜜炙后甘草昔和甘草酸 的含量增加(P SPD-M20A DAD 二极管阵列检测器、LC-10 ADvp 泵、 FCV-10ALvp四元低压梯度洗脱系统、LC-Solution色谱数据工作站;梅特勒托利 多AE240电子天平（瑞士 Mettler Toledo公司）；Millipore超纯水机；超声波清洗 器（型号SK250LH,上海科导超声仪器有限公司）。甲醇（色谱纯，美国J.T.Baker 公司）；水为超纯水；其余试剂皆为分析纯。1.2试药对照品甘草苷（批号：06121824）及甘草酸（批号：06110101）由上海同 田生物科技有限公司提供。甘草（
3、批号：20071229；产地：甘肃）及炙甘草（批号： 20071229 ；产地：甘肃）药材购自徐州医药股份有限公司中药饮片厂，经徐州医 学院附属医院杜长俊副主任中药师鉴定为真品。甘草和炙甘草为豆科植物甘草的 干燥根及根茎的炮制加工品。2实验方法与结果2.1色谱条件色谱柱：Zorbax SB-C18反向色谱柱（4.6 mmx250 mm， 5 pm）, 流速1.0 ml-min-1,柱温30C,检测波长分别为250 nm和276 nm。进样量：20 pl, 流动相：A为0.1%（体积分数）甲酸水溶液，B为甲醇，用前超声脱气30 min,洗 脱程序见表1。记录65 min色谱图。理论塔板数按甘草苷
4、和甘草酸峰计应不低于 4000。表1梯度洗脱程序时间(min)流速(m-lmin-1)A(%)B(%)01.0301.0501.0651.02.2对照品溶液的制备精密称取甘草苷对照品3.68 mg、甘草酸对照品2.46 mg,用70%甲醇水溶液溶解并定容于5 ml棕色容量瓶中，得甘草苷0.736 gL1 及甘草酸0.492 gL-1的0号混合对照品标准贮备溶液。从中精密量取适量，用流 动相配成甘草苷浓度为 0.368、0.184、0.092、0.046、0.0184、0.0092 g-L-1 及甘 草酸浓度为 0.246、0.123、0.0615、0.03075、0.0123、0.00615
5、gL-i 的 1 6 号混 合对照品贮备液。2.3供试品溶液的制备精密称取甘草粉末及炙甘草粉末(过60目筛，烘干全 恒重)各0.2 g,置具塞锥形瓶中，精密加入20 ml 70%甲醇，称定重量，室温放 置1 h后超声处理(功率250 W，频率40 kHz)40 min，取出锥形瓶擦十后放冷到 室温，再称重，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，上清液经0.45 pm滤膜滤 过，取续滤液供HPLC分析。2.4方法学考察2.4.1线性关系考察精密吸取“2.2”项下已制备的各不同浓度的混合标准贮 备液(06号)20 pl注入色谱仪，测定峰面积，以甘草苷或甘草酸浓度gL-1)为横 坐标(X)，峰面积为纵坐
6、标(Y)，进行线性回归，得直线回归方程。2.4.2检测限和定量限取0号混合对照品标准贮备液，用0.1%甲酸水溶液- 甲醇(70:30)依次稀释制成一系列由高到低的梯度浓度溶液并进样分析，测定峰面 积约为噪声10倍(S/N=10)时的进样浓度为定量限(QOD)，测定峰面积约为噪声3 倍(S/N=3)时的进样浓度为检测限(LOD)。结果甘草苷和甘草酸的QOD分别为 0.0069 mg-L-1 和 0.0077 mg-L-1，LOD 分别为 0.0023 mg-L-1 和 0.0031 mgL-1。2.4.3精密度试验精密移取1号混合标准贮备液20pl，重复进样6次(2次进 样之间间隔约30min)
7、，测定峰面积，结果甘草苷平均峰面积相对标准偏差 (RSD)=0.498%，甘草酸平均峰面积RSD=0.742%;精密移取1号混合标准贮备液 20 pl，连续分析6天，每天进样1次，测定峰面积，结果甘草苷平均峰面积 RSD=1.67%，甘草酸平均峰面积RSD=2.71%。结果表明仪器精密度良好。2.4.4重现性试验取炙甘草样品6份，按“2.3”项下供试品溶液的制备方法处理， 制成6份供试品溶液，按“2.1”项下方法测定，结果甘草苷平均含量为0.09683 g-L-1，RSD=1.83%；甘草酸平均含量为0.1358 g*L-1，RSD=2.36%。结果表明此 方法重现性良好。2.4.5稳定性试验
8、取同一份炙甘草样品溶液。在配制后0、2、4、6、8、12、 24 h进样，测定峰面积，结果甘草苷平均峰面积RSD=0.827%,甘草酸平均峰面 积RSD=0.964%。结果表明24 h内样品溶液稳定。2.4.6回收率试验精密移取0.2 ml已知甘草苷及甘草酸含量的炙甘草样品溶 液9份，每3份分别精密加入甘草苷浓度为0.1 g-L-1及甘草酸浓度为0.14 g-L-1 的混合对照品溶液0.16、0.20、0.24 ml，按“2.1”项下方法同时测定甘草苷和甘 草酸的含量。2.5不同样品中甘草苷和甘草酸含量测定取甘草和炙甘草样品各6份，按照 “2.3”项下方法制备，按“2.1”项下方法测定。统计分
9、析：计量资料以土 s表 示，以t检验比较组间差异。结果表明，甘草经蜜炙后甘草苷和甘草酸的含量均 增 口 (PV0.01)。3讨论3.1提取溶剂的选择我们比较了 80%氨性甲醇提取后酸化定容、80%甲醇、 70%乙醇(中国药典2005版测定甘草苷的提取溶剂)、70%甲醇对甘草苷和甘草酸 的提取效率及色谱峰峰型的影响，其中70%甲醇效果相对略好，又考虑到流动相 采用甲醇-0.1%甲酸水溶液，因此，采用70%甲醇冷浸超声提取。3.2检测波长的选择采用DAD检测器，在完成色谱数据采集后，可在不同 的提取波长下进行定量分析。参考中国药典2005版规定的甘草苷和甘草酸的检 测波长，再结合甘草苷和甘草酸的D
10、AD全波长扫描图谱，最终选择276 nm为 甘草苷的检测波长，250 nm为甘草酸的检测波长。3.3流动相系统的选择甘草的成分复杂，为尽可能地使甘草成分达到较好的 分离效果，我们对实验条件进行了一系列优化。流动相方面，试验了乙腈-水囹、 甲醇-水、乙腈-甲醇-水等，发现当流动相中有乙腈时，出峰较晚的组分分离效果 不佳，且乙腈试剂昂贵，毒性大，选用甲醇-水二元系统进行分离测定，可使待 测组分和干扰组分较有效分离。由于甘草酸为有机弱酸，且易解离，峰形拖尾， 因此，考虑在流动相中加入一定量的酸作为抑制剂，之所以用甲酸而不用冰醋酸 1、磷酸U、磷酸缓冲盐等，是考虑到后续可直接采用已建立的流动相条件进
11、行液质联用分析及对色谱柱的保护。总之，选择0.1%甲酸水溶液-甲醇作为流动 相，简单、经济、有效。3.4固定相的选择预实验考察了大连依利特 Hypersil ODS2、大连依利特 Kromasil C18(250 mm)、大连依利特 Kromasil C18(150 mm)、大连依利特 Hypersil BDS C18、岛津 Shim-Pack CLC-ODS、安捷伦 Zorbax SB-C18 ODS 等色谱柱， 结果发现，Zorbax SB-C18 ODS色谱柱给出的甘草苷和甘草酸的峰形及分离度均 较好。3.5柱温的选择在确定固定相和流动相的情况下，分别考察了 25、30、35C 柱温，预
12、实验结果表明30C柱温下峰形及分离度较好。3.6炮制因素对甘草苷和甘草酸影响的分析为使测定结果更准确地反映炮 制因素引起的化学成分变化，我们选用了正在上市销售的同一产地、同一批次的 甘草和炙甘草药材。检测结果表明，炮制因素可显著增加甘草中甘草苷和甘草酸 的含量。其原因可能是甘草苷和甘草酸热稳定性好，甘草经蜜炙后蜂蜜充分渗入 甘草组织内部置换出部分水分，且蜂蜜覆盖于甘草表面能防止空气中氧及二氧化 碳与甘草中有效成分发生化学反应，有效延长了甘草的贮藏时间。由此可推断中 医用药讲究炮制，目的是利用多种辅料的助溶作用或成分结构发生变化，提高有 效成分的检出率，从而提高疗效，改变适应证。参考文献1 崔淑
13、芬，张信青，Frank SCL等.HPLC指纹图谱应用于炙甘草的炮制 研究J.中成药,2007, 29(11):16361639.2 王国喜，门闯.浅谈中药炮制J.河南中医,2008, 28(12):8989.3 王明喜，石志强.生甘草炙甘草临证应用考辨J.实用中医内科杂志， 2005, 19(4):383.4 闫永红，段天璇，王文全，等.野生及栽培甘草HPLC指纹图谱J.中国 天然药物,2006, 4(2): 116120.5 Xie J, Wang W, Zhang Y, et al. Simultaneous analysis of glycyrrhizin, paeoniflorin, quercetin, ferulic acid, liquiritin, formononetin, benzoic acid and isoliquiritigenin in the Chinese proprietary medicine Xiao Yao Wan by HPLC J. J Pharm Biomed Anal, 2007, 45(3): 450455.
