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1、DNA 的定量测定-二苯胺法一、实验目的1学习和掌握用浓盐法从动物肝脏中提取DNA的原理和方法；2学习和掌握用二苯胺法测定DNA含量的原理和方法。二、实验原理1. DNA分子中的脱氧核糖基，在酸性溶液中变成3-羟基-Y -酮基戊醛，与二苯胺试剂作 用生成蓝色化合物（入max=595nm）。2. 在DNA浓度为20-200g/ml的范围内，吸光度与DNA浓度成正比，可用比色法测定。三、实验仪器试管移液管7220 分光光度计四、实验试剂1、DNA标准液（200ug/ml）：称取10mgDNA钠盐溶于5mol/l氢氧化钠溶液并稀释至100ml。2、二苯胺试剂：A液：称取纯二苯胺1.50g，溶于100
2、ml冰乙酸，再加浓硫酸1.5m 1。贮于棕色瓶中。B液：称取1.6ml乙醛溶于100ml蒸馏水中，临用时配制临用时，将20mlA液和0.1mlB液混合即可五、实验验步骤1. 标准曲线的绘制 取干燥的试管6支，编号，按下表加入试剂：0123456 （样液）DNA标准液/ml00.40.81.21.62.01.0蒸馏水/ml2.01.61.20.80.401.0一苯胺试剂/ml404.04.04.04.04.04.0加毕，混匀，在60度水浴中保温45分钟，冷却后，在595nm波长下测吸光度，以吸光度 对 DNA 浓度作标准曲线。2. 样品测定吸取DNA样液10ml,加入蒸馏水10ml,混匀。然后加
3、入二苯胺溶液40ml,加毕，混匀， 在60度水浴中保温45分钟，冷却后，在595nm波长下测吸光度，根据所测得的吸光度对 照标准曲线求得DNA的质量。六、实验结果0123456 （样液）DNA标准液浓度（Mg/ml）013.3326.6640.0053.336666A595nm00.0850.1500.2540.3640.4440.115A595nm00.0820.1510.2520.3640.4430.115A595nm00.0800.1500.2520.3630.4420.115A595nm（平均）00.0820.1500.2530.3640.4430.115根据实验数据制得标准曲线如下：标准曲线y 二 0.0068x - 0.0107DNA标准液浓度（ug/ml）由上表可知样液的吸光度y=0.115，贝I由标准曲线得出DNA样液的浓度x=18.49p g/ml。故 样品中DNA的质量=18.49X6宁1.0=110.94g七、实验分析1. 测定 DNA 含量的方法还有哪些原理?荧光法，用Pico Green荧光染料，测定DNA浓度比较灵敏，并且适合测量低浓度和微量DNA，并且受其它杂质的影响不大，缺点要有专门的荧光检测仪器，试剂比较昂贵。2. 实验中加入乙醛的目的?甲醛引起DNA的断裂损伤,DNA在酸性条件下加热，在反应液中加入少量乙醛可以提高 反应灵敏度.
