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1、凯氏定氮蒸馏A为蒸气发生室，P3为其开关，P1为出水开关，B为蒸馏室，与出气管M 相接，M管插入盛有定量硼酸液的锥形瓶，B室内有Y型管，一端与A室相通， 另一端经P4与漏斗D相连，可经此将样品及试剂加入B室，F为冷凝管，E为 进水管，水经F、G、K而流出，蒸馏时依次在B室加入消化好的样品及NaOH, 二者反应产生氨，经 M 酸吸收。操作步骤：一、样品消化称取适量样品移入干燥的 100ml 凯氏烧瓶中（注意勿沾于瓶口或瓶颈上）。 加入 0.2g 硫酸铜、 6g 硫酸钾，稍摇匀后瓶口放一小漏斗，加入浓硫酸 20ml， 小瓷片两粒，摇匀。将烧瓶以 45 度角斜支于有小孔的石棉网上，使用万用电炉， 在
2、通风橱中加热消化。开始时用低温加热，不要使沸液冲到瓶颈。待内容物全部 炭化，泡沫停止后，再升高温度保持微沸，消化至液体呈蓝绿色澄清透明后，继 续加热0.5h，取下放冷，小心加20mL水，放冷后，无损转移到100mL容量瓶 中，加水定容至刻度，混匀备用即为消化液。（硫酸开始分解并放出SO2白烟后， 适当加强火力，继续消化，直至消化液呈透明蓝绿色为止。）试剂空白实验：取与样品消化相同的cuso4、k2so4、浓h2so4，按以上同 样方法进行消化，冷却，加水定容至100 mL，得试剂空白消化液。二、定氮装置的检查与洗涤 检查微量定氮装置是否装好。在蒸汽发生瓶内装水约2/3，加甲基红指示剂数滴及数毫
3、升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠（或沸石）以防止暴沸。测定前定氮装置如下法洗涤 23 次：从样品进口加水适量（约 1/3）通入蒸 汽煮沸，产生的蒸汽冲洗冷凝管，数分钟后关闭夹子a,使反应器中的废液倒吸 流到反应室外层，打开夹子b，由橡皮管排除，如此数次，即可使用。三、碱化蒸馏量取硼酸试剂20mL于三角瓶中，加入混合指示剂23滴，并使冷凝管的下 端插入硼酸液面下，在螺旋夹a关闭、b开启的状态下，准确吸取lO.OmL样品 消化液，由小漏斗流入反应室，并以10mL蒸馏水洗涤进口流入反应室，棒状玻 塞旋紧。使 l0mLNaOH 溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，用少 量水冲洗立即将玻塞
4、盖紧，并加水于小烧杯以防漏气，开启螺旋夹a关闭b，开 始蒸馏。通入蒸汽蒸腾lOmin后，移动接收瓶，液面离开凝管下端，再蒸馏2min。 然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下三角瓶，准备滴定。同时吸取lO.OmL试剂空白消化液按上法蒸馏操作。四、样品滴定以0.01mol/L盐酸溶液滴定至微红色为终点。五、数据记录样品消化液（mL）消耗盐酸标准溶液平均值（mL）（三次测定的平均值）(V1 - V 2) x c x141OOOx F x 1OO结果计算lOm x1OO式中 x 样品中蛋白质的含量（%）V1样品消耗盐酸标准液的体积（mL）V2试剂空白消耗盐酸标准液的体积（mL）c盐酸标准液的浓度（m
5、ol/L）14 N的摩尔质量（g/mol）m样品的质量（g）F氮换算为蛋白质的系数。蛋白质中氮含量一般为15%17.6%，按16%乘以 6.25即为蛋白质量。计算结果保留三维有效数字。注意事项及说明1. 本法也适用于半固体试样以及液体样品检测。半固体试样一般取样范围为2.005.00g；液体样品取样10.0mL25.0mL （约相当氮30mg40mg）。若检 测液体样品，结果以g/100mL表示。2. 消化时，若样品含糖高或含脂较多时，注意控制加热温度，以免大量泡沫喷 出凯氏烧瓶，造成样品损失。可加入少量辛醇或液体石蜡，或硅消泡剂减少 泡沫产生。3. 消化时应该注意旋转凯氏烧瓶，将附在瓶壁上的碳粒冲下，对样品彻底消化。 若样品不易消化至澄清透明，可将凯氏烧瓶中溶液冷却，加入数滴过氧化氢 后再继续加热至完全消化。4. 硼酸吸收液的温度不应超过40oC,否则氮吸收减弱，造成检测结果偏低。可 把接收瓶置于冷水浴中。5. 在重复性条件下获得两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10%。
