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1、内切葡聚糖酶基因在巨大芽孢杆菌中重组表达载体的构建生物科学 2003 级 廖俊华15编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径，学海无涯苦作舟页码：第1页 共1页指导教师 陈 惠 教 授摘要：以生物化学与分子生物学实验室克隆并测序的枯草芽孢杆菌C-36内切葡聚糖酶基因（Genbank 登录号：DQ782954）为模板，通过PCR将编码信号肽的序列去除，然后与pMD18-T Vector克隆载体连接，构建pMD18-T Vector亚克隆载体。对pMD18-T Vector质粒先进行Bgl单酶切，回收后再进行Sph单酶切，通过两次单酶切胶回收内切葡聚糖酶基因（不含信号肽），并构建巨大芽孢杆菌重
2、组表达载体pHEC-End，将重组表达载体转化到大肠杆菌DH5中。通过对转化子进行菌落PCR和质粒的酶切检测证明成功构建了内切葡聚糖酶的巨大芽孢杆菌表达载体。关键词：巨大芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌， 内切葡聚糖酶 ，重组表达载体Construction of eukaryotic Expression Vector of the gene of endoglucanase in Bacillus MegateriumLIAO Jun-hua Biological Science, Grade 2003Directed by Chen Hui( Prof)Abstract: By the way o
3、f PCR, the sequence coming from endoglucanase gene (Genbank No. DQ782954 ) in B.subtilis C-36 strain and coding for the signal peptide of endoglucanase was removed.The endoglucanase gene was cloned and sequenced in the Laboratory of Biochemistry and Molecular Biology.Then the gene without the signal
4、 peptide sequence was ligated with the clone plasmid pMD18-T.The pMD18-T Vector was constructed. First, the pasmid was cuted by Bgl.Then,the pasmid was cuted by Sph.By double enzyme-cut , the gene of endoglucanase in B.subtilis C-36 strain without signal peptide was recived. The eukaryotic expressio
5、n vector pHEC-End was constructed.Eventually, the eukaryotic expression vector was transformed into competent E.coli DH5 . By the way of colony PCR and restriction enzyme digesting analysis, the eukaryotic expression vector of the gene of endoglucanase in Bacillus Megaterium was constructed succesfu
6、lly.Keywords: Bacillus Megaterium，Bacillus subtilis，endoglucanase，eukaryotic expression vector纤维素酶是一类能够降解纤维素，使之生成纤维二糖、葡萄糖等一系列酶的总称，按各酶功能的不同可以分为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和-葡萄糖苷酶三大类1。纤维素被它降解后可转化为人类急需的能源、食物、化工原料，对于人类社会解决食物短缺和能源危机具有重大的现实意义2。随着中性纤维素酶和碱性纤维素酶在棉织品水洗整理工艺及洗涤剂工业中的成功应用，细菌纤维素酶制剂已显示出良好的使用性能和巨大的经济价值3。纤维素酶成本高以及酶
7、活力低已成为制约纤维素酶广泛应用的两大瓶颈，因此，构建高效表达的基因工程菌是降低纤维素酶成本、提高产量的有效手段。几乎所有已克隆到的纤维素酶基因都在大肠杆菌中得到了表达，但是都几乎存在着表达量低、分离提纯困难的缺陷。而芽孢杆菌因具有独特的蛋白分泌系统，使得在表达外源蛋白的宿主菌中深受青睐。其中枯草芽孢杆菌是应用较广泛的一种外源蛋白表达系统，并且已用于商业化生产酶制剂，例如，Genecor 厂家就以该菌作为生产碱性蛋白酶的工程菌4。近年来，巨大芽孢杆菌也在这方面显示出了较好的应用前景，与枯草芽孢杆菌相比，巨大芽孢杆菌还具有两大优点：首先是它不具有碱性蛋白酶，从而使外源蛋白能很好的表达而不被降解；
8、再次是重组质粒能够在宿主菌中稳定存在5。有很多蛋白已经成功地在巨大芽孢杆菌中得到过量表达，如：Rygus和Hillen6（1991）在巨大芽孢杆菌中成功地表达了四种外源蛋白基因，在木糖操作子的调控下，这些基因的表达提高130到350倍不等，且未发现蛋白酶水解情况。目前还未见有关在巨大芽孢杆菌中表达内切葡聚糖酶的报道，四川农业大学生物化学实验室通过自行筛选得到一株产内切葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌并克隆到了编码该酶的基因（Genbank No. DQ782954），拟在此基础上构建该基因的巨大芽孢杆菌表达载体，实现该基因在巨大芽孢杆菌中的分泌表达。本实验将不含信号肽枯草芽孢杆菌C-36内切葡聚糖酶基因
9、与巨大芽孢杆菌表达载体pHIS1525进行连接，构建重组表达载体，使之能在表达载体自身信号肽的引导下进行融合表达，为进一步研究枯草芽孢杆菌C-36内切葡聚糖酶基因在巨大芽孢杆菌中的高效表达及基因工程菌投入生产奠定基础。1 材料与方法1.1 菌株及载体：本工作所使用的菌株和质粒见表1。表1 实验所用的菌株及质粒Tab 1 The strain and plasmid used in the experimentstrain/plasmidCharacteristicssourceJM109recA1 supE44 endA1 hsdR17 gyrA96 relA1 thi(lac-proAB)F
10、Stored in this labDH5supE44lacU169(80lacZM15) recA1Stored in this labpMD18-T VectorAmpr lacZTaKaRa BiotechnologypHIS1525Tetr Ampr xylR PxylAMoBiTecB3 plasmidpMD18-T Vector including the endoglucanase gene Constructed in this lab1.2 分子生物学试剂：引物由上海英俊生物技术有限公司合成；BglII、SphI、重组Taq DNA Polymerase、dNTP、T4 DN
11、A Ligase、pMD18-T Vector购自TaKaRa Biotechnology；质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、DNA Marker III、DNA Marker VII、DNA/Hind III购自天为时代；氨苄青霉素购自上海生工。1.3 主要药品NaCl、胰蛋白胨、酵母浸出粉、琼脂粉、琼脂糖、0.1mol/L CaCl2、甘油（终浓度为30%）。1.4 主要仪器：电热恒温培养箱、HZQ-F全温振荡培养箱、酸碱pH计、TGL-16G台式普通离心机、板式电泳槽、电热恒温水浴锅、PCR仪、凝胶成像仪等。1.5 培养基、抗生素贮存液及琼脂糖电泳缓冲液：LB培养基：1%胰蛋白胨，1% N
12、aCl，0.5%酵母浸出粉，pH7.0（用1mol/L的NaOH调PH值）；配制固体培养基时需加入1.5%-2.0%的琼脂粉；配制抗生素培养基时需加入氨苄青霉素（终浓度为100g/mL）。氨苄青霉素（Amp）贮存液7：100g/mL（溶于双蒸水中），过滤除菌，小份分装（1mL/份）后，-20保存。琼脂糖电泳缓冲液8：5TBE贮存液：54g Tris碱，27.5g硼酸，20mL 0.5mol/L EDTA（pH8.0），溶于1L去离子水，用时稀释10倍。0.5mol/L EDTA（pH8.0）：将186.1g二水乙二胺四乙酸（EDTA-Na.2H2O）加入800mL水中，用磁力搅拌器剧烈搅拌，用
13、NaOH调节pH至8.0，定容至1L。0.7%的琼脂糖凝胶：称取0.7g琼脂糖于100 mL 0.5TBE中，用微波炉加热置溶液澄清为止，然后加入5L的Gold View核酸染料，混匀即可用。1.6 方法.1.6.1 引物的设计：根据已经克隆并测序的内切葡聚糖酶基因（Genbank 登录号：DQ782954），结合信号肽预测结果，应用Primer premier5.0软件设计一对引物，使其通过PCR去掉该基因自身信号肽编码序列，同时加入适当的酶切位点（BglII、SphI），使其能够通过连接将该基因置于表达载体信号肽编码序列之后（表达载体pHIS1525的多克隆位点序列如图1），且保证正确的阅
14、读框。已经预测的枯草芽孢杆菌C-36内切葡聚糖酶蛋白序列信号肽切割位点在29位和30位氨基酸残基之间，成熟蛋白为470氨基酸多肽，因此设计引物如下：上游引物（P1）：5AGATCTCAGCAGAGACAAAAACGCCAGT 3下游引物（P2）：5GCATGCCTAATTTGGTTCTGTTCCCCAA 3下划线是引入的酶切位点，分别是Bgl、Sph；A是为了不改变阅读框而引入的碱基。图1 pHIS1525的多克隆位点序列Fig1 Sequence of the multiple cloning sites(MCS)of pHIS15251.6.2 目的基因的获得：1.6.2.1 B3质粒的提
15、取及其PCR接种一环B3菌株于10mL LB液体培养基中，37200r/min培养过夜，用质粒提取试剂盒按操作说明提取B3质粒9。以提取的B3质粒为模板根据设计合成的引物进行PCR10，通过PCR获得目的基因，其反应体系如表2：表2 PCR反应体系Table 2 Composition of PCR试剂名称 用量ddH2O 32.5L10PCR buffer 5.0L25mmol/L MgCl2 2.0LP1 1.0L P2 1.0LdNTP mixture 6.0L模板DNA 2.0L Taq 聚合酶 0.5LTotal volume50.0L按上述顺序加入各组分后混合均匀，PCR反应参数为：94预变性2 min，94变性1min，65退火1min，72延伸90s，30个循环后，72再延伸10min，4保存。反应结束后取3LPCR产物进行0.7%琼脂糖凝胶电泳检测。1.6.2.2 PCR产物的纯化由于克隆需要的DNA片段需要较高的纯度，PCR产物需经
