乳清蛋白酶解条件优化

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1、乳清蛋白酶解条件优化孙洋;钱方;赵磊;刘晓慧;牟光庆【摘 要】用二次回归正交旋转组合设计对乳清蛋白酶解条件进行优化,建立酶法水 解乳清蛋白的水解度与水解温度、水解时间、加酶量等三因素的正交回归模型.结 果表明:在反应温度57C、加酶量8 214 U/g蛋白条件下酶解114 min,可获得中 性蛋白酶水解乳清蛋白的最大水解度11.72,与模型值基本相符.期刊名称】食品与机械年(卷),期】2015(031)001【总页数】5页(P199-203) 【关键词】 乳清蛋白;蛋白酶;酶法水解【作 者】 孙洋;钱方;赵磊;刘晓慧;牟光庆【作者单位】 大连工业大学信息科学与工程学院,辽宁大连116034;大

2、连工业大学 食品学院,辽宁大连116034;大连工业大学食品学院,辽宁大连116034;大连工业大 学食品学院,辽宁大连116034;大连工业大学食品学院,辽宁大连116034【正文语种】 中 文近年来随着人们营养健康意识的增强，蛋白质和脂肪含量相当于原料乳10倍的干 酪，成为世界上唯一保持连续上升的乳制品1。按生产 1t 干酪排放 9t 乳清计， 每年有上亿吨的乳清等待利用和处理2。乳清不仅产量大，且营养丰富(含乳 清蛋白、脂肪、乳糖、矿物质和水溶性维生素等)，必需氨基酸组成完全符合或超 出FAO/WHO要求3。由于蛋白酶能部分降解乳清蛋白多肽骨架，增加特殊功能基团，具有改变乳清蛋白的乳化性

3、、稳定性等功能特性4。也是降低其过 敏反应的有效方法之一5。本研究为便于乳清蛋白酶解后直接用于乳制品中， 因此在自然pH下对乳清蛋白预处理及酶解条件进行优化，以提高乳清蛋白酶解产 物的利用率和营养价值。1 材料与方法1.1 材料乳清浓缩蛋白（WPC80 ）:美国哥兰比亚乳业公司；中性蛋白酶：酶活14.6万U/g，广西南宁庞博生物工程有限公司；木瓜蛋白酶：酶活21.4万U/g，广西南宁庞博生物工程有限公司；胰蛋白酶：酶活10.0万U/g，北京索莱宝科技有限公司。1.2 仪器与设备电热恒温水浴锅：DK-S22型，上海精密实验设备有限公司；光栅分光光度计： 722型，山东高密彩虹分析仪器有限公司；精

4、密pH计：pH S-3B型，上海雷磁仪器厂；多管架自动平衡离心机：TDZ5-WS型，湘仪离心机仪器有限公司。1.3 方法1.3.1 测定项目及方法（1）蛋白酶活力测定：福林酚法6，7。（2）蛋白含量测定：微量凯氏定氮法8。（3 ）蛋白水解度（DH ）测定：改进pH-stat法9,10。1.3.2预处理方式对乳清蛋白酶解的影响分别采用63C/30min,80C/10min, 95C/5min的预处理方式对乳清蛋白WPC80进行处理，以未经预处理的作对照。 水解条件：WPC80 8%，初始pH 6.8，木瓜蛋白酶量5 000U/g蛋白，温度50C, 时间60min。通过乳清蛋白水解程度来确定最佳的

5、预处理方式。1.3.3 不同蛋白酶水解乳清蛋白的效果比较选用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶，在加酶量5 OOOU/g蛋白，初始pH 6.8 ,50C, 60min的条件下对终浓度8% 的乳清蛋白(WPC80 )进行酶解，并经沸水10min，冷至室温后，通过比较水解 程度来确定乳清蛋白酶解的最佳酶。1.3.4 单因素试验(1)加酶量对酶解乳清蛋白的影响：在初始pH 6.8、水解温度50C、水解60min条件下，用最佳酶对终浓度8%的乳清蛋白进行酶解，分别测定在1 000,3 000, 5 000,7 000,9 000U/g蛋白加酶量的水解度。(2 )水解温度对酶解乳清蛋白的影响：在初始pH

6、6.8、加酶量5 000U/g蛋白、 水解60min条件下，用最佳酶对终浓度8%的乳清蛋白进行酶解，分别测定在40, 45,50,55,60C水解温度下的水解度。(3 )水解时间对酶解乳清蛋白的影响：在初始pH 6.8、水解温度50C、加酶量5 000U/g蛋白条件下，用最佳酶对终浓度8%的乳清蛋白进行酶解，分别测定30, 60,90, 120, 150min水解时间的水解度。1.3.5 正交旋转回归试验设计 基于单因素试验结果,以木瓜蛋白酶的水解温度、水 解时间和加酶量3个因素为自变量,以乳清蛋白水解度为响应值,设计20个试验 点的正交旋转回归试验,保证试验点最小的前提下,提高乳清蛋白酶解效

7、率,并用 Design Expert 8.0.6统计软件对结果进行分析。2 结果与分析2.1 预处理方式对酶解乳清蛋白的影响 由于乳清蛋白的热稳定性较差,不同的预处理方式对其酶解效果影响较大。为了得 到最佳水解效果，按表1的预处理方式及水解条件酶解乳清蛋白WPC,并测其水 解度。由图1可知，其中80C处理10min的水解度最大，达9.21%。所以选用80C处 理10min对酶解前乳清蛋白进行预处理。图1不同预处理方式水解乳清蛋白的比较Figure 1 Comparison of different pretreatments of enzymolysis of whey protein2.2

8、不同蛋白酶水解乳清蛋白的效果比较考虑到酶解反应受温度、加酶量、底物浓度和水解时间等多种因素影响。为寻找水 解乳清蛋白的适宜酶及其最佳酶解条件，本研究分别用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和 胰蛋白酶 3 种酶，在相同酶解条件水解乳清蛋白，比较其水解程度。由图 2 可知， 木瓜蛋白酶水解度最大，达8.96%。因此选用木瓜蛋白酶作为乳清蛋白水解最佳 用酶。图2不同蛋白酶水解乳清蛋白的比较Figure 2 Comparison of differentproteases of enzymolysis of whey protein2.3 单因素试验2.3.1加酶量对酶解乳清蛋白的影响由图3可知，在同一初始pH

9、、水解温度和时 间下，当木瓜蛋白酶量低于5 000U/g蛋白时，乳清蛋白水解度随酶量的增加而明 显升高；而加酶量高于5 000U/g蛋白时，由于底物浓度和酶逐渐达到饱和，水解 度升高幅度不明显。因此，初步确定木瓜蛋白酶水解乳清蛋白适宜用酶量为5 000U/g蛋白，相应水解度DH为9.65%。图3加酶量对蛋白酶水解乳清蛋白的影响Figure 3 Effects of different enzyme dosage on whey protein enzymolysis2.3.2水解温度对酶解乳清蛋白的影响由图4可知，在同一初始pH、水解时间和 加酶量下，酶解温度控制在4055C时，乳清蛋白水解度

10、随温度上升而增大，而 高于 55C时，则随着温度升高，水解度降低，说明酶活力下降。木瓜蛋白酶水解 孚滴蛋白的适宜水解温度为55C,相应水解度DH为9.96%。2.3.3水解时间对酶解乳清蛋白的影响由图5可知，在同一水解温度、初始pH值 和加酶量下，乳清蛋白水解度随水解时间的延长而升高。而水解90min后，水解 度趋势线变缓。因此，初步确定木瓜蛋白酶水解乳清蛋白适宜水解时间为 90min， 相应水解度DH为9.87%。图4水解温度对酶解乳清蛋白的影响Figure 4 Effects of different temperature on whey protein enzymolysis图5水解时

11、间对酶解乳清蛋白的影响Figure 5 Effects of different time on whey protein enzymolysis2.4 正交旋转回归试验2.4.1 正交旋转回归设计酶解乳清蛋白试验结果分析根据单因素试验结果确定的回 归正交旋转试验因素水平取值见表1，木瓜蛋白酶解乳清蛋白回归正交旋转试验结 果见表2 ，方差分析见表3、 4。用Design-Expert软件进行回归分析，对各因素回归拟合后得回归方程：表1正交旋转回归设计的因素水平编码表Table 1 Factors level coding schedule of regression orthogonal ro

12、tary tests 编码 X1 水解温度/C X2 时间 /min X3 加酶量/（Ug-1 蛋白）+ 1.682 63.41 140.45 8 363.59 + 1 60 120 7 000 0 55 90 5 0001 50 60 3 0001.682 46.59 39.55 1 636.41 表2正交旋转回归设计酶解乳清蛋白试验与结果Table 2 Design and results of orthogonal rotational regression of whey protein enzymolysis 序号 X1 X2 X3 DH 水解度/%1 - 1 - 1 - 1 7.4

13、4 2 + 1 - 1 - 1 7.83 3 - 1 +1 - 1 7.94 4 + 1 +1 1 8.37 51 1 +1 10.40 6+1 1 +1 10.80 71 +1 +1 10.71 8+1 +1 +1 11.22 9-1.682 0 0 9.07 10 +1.682 0 0 9.83 11 0 -1.682 0 9.41 12 0 +1.682 0 10.82 13 0 0-1.682 7.56 14 0 0 +1.682 11.30 15 0 0 0 10.2316 0 0 0 10.67 17 0 0 0 10.23 18 0 0 0 10.58 19 0 0 0 10.3

14、3 20 0 0 0 10.28由表3可知，模型交互项X1X2、X1X3、X2X3及二次项X22差异不显著，模型 次项X2、X3及二次项X12、X32差异极显著，模型一次项X1差异显著，说明 响应面分析所选的3个主效应显著。其中各种因素间的交互作用较小。同时由F 值(各项均方/剩余误差均方)可看出，水解温度、水解时间、加酶量3个因素中 加酶量对乳清蛋白水解度影响最大，其次为水解时间和温度。表 3 正交试验结果方差分析表 Table 3 Variance analysis table of the result of orthogonal tests *为显著(Pv0.05),* 为高度显著(P

15、v0.01);F0.01(1,10)二 10.04 , F0.05 (1,10)二 4.96 ; F0.01 (5,5)二 11.0 , F0.05 ( 5 , 5 )= 5.05 ; F0.01 (9,10)二 4.95 , F0.05 (9,10)二 3.02。变异来源系数估 计值平方和SS自由度均方MS F值显著性截距10.40 X1 0.22 0.66 1 0.66 7.10 *X2 0.30 1.26 1 1.26 13.55 *X3 1.31 23.30 1 23.30 250.54 *X1X2 0.02 0.00 1 0.00 0.03 X1X3 0.01 0.00 1 0.00

16、 0.01 X2X3 0.04 0.01 1 0.01 0.13 *X12 0.39 2.20 1 2.20 23.66 X22 0.16 0.35 1 0.35 3.76 *X32 0.40 2.28 1 2.28 24.52*回归模型30.35 19 29.42 9 3.27 35.16剩余误差 0.93 10 0.09纯误差 0.18 5 0.04失拟项 0.75 5 0.15 4.17总变异 表4乳清蛋白水解度模型的方差分析Table 4 Variance analysis of the model of DH模型统计结果均值9.75标准差1.26复相关系数的平方96.94复相关系数 98.46变异系数12.96 本试验模