白菜EST-SSR信息分析与标记的建立

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1、白菜EST-SSR信息分析与标记的建立忻雅1，崔海瑞，卢美贞1,姚艳玲1,金基强1,林容杓2,崔水莲（1.浙江大学农业与生物技术学院原子核农业科学研究所，椀州029 2.忠南大学园艺系，大田05764韩国）摘要：对4584条白菜EST进行了搜索，共发掘474个SSR,出现的频率为10.3%包括40种重复基元。 其中二核苷酸和三核苷酸重复类型占主导地二者出现的频率基本相近占总SSR的近83%；其它重复类 型所占比例均不足5%。GA和GAA是二、三核苷酸中的优势重复类型分别占二、三核苷酸重复类型的1.5% 和37.5%挑选其中符合引物设计的5条设计了EST-SSR引物。在合适的3。3反应体系下，以

2、构建ST的 白菜自交系A的DNA为模板，对设计的EST-SSR引物进行筛选，发现5对EST-SSR引物都能扩增出产物。 进一步用这些可扩增的引物对9个白菜品种进行PCR扩增，发现7对引物显示多态性，占可扩增引物的 46.7%此结果表明，根据ST建立EST-SSR标记是一条简便而又有效的途径。关键词：EST； SSR信息；标记建立；白菜Data mining for SSRs in ESTnd EST-SSR marker development in Chinese cabbageXin Ya，Cui Hairu基金项目韩国科学技术厅资助项目“大白菜分子标记的建立及其定位”的T部分：98-04

3、02-0601-5） 通讯作者Author for correspondence E-mail 1，Lu Meizhen, Yio Yinling, Jin Jiqiang, Lim yongpy , Choi suryun（1. Institute of Nuclear and Agricultural SciencCollege of Agriculture and BiotechnoloZhejiang University Hangzhou 310029 2. Department of Horticulture, Chungnam National UniverTyjeon 305-

4、764 KoreAbstract 4584 ESTs of Chinese cabbage were screened and 474 SSRs including 40 kinds of repeat motifs were mined out, accountingfor 10.3% of ESTs. Dinucleotideand trinucleotiderepeats, with similar frequencyand accounting for 83% together in all SSRs, were dominant, while the frequency for ot

5、her repeat type is below 5% each. GA and GAA are the most frequent motifs, accounting for 71.5% and 37.5% in dinucleotide and trinucleotide repeats respectively15 primer pairs for EST-SSRs were designed. Under a suitable PCR system, primers were screened against genomic DNA of inbreed line A from wh

6、ich the cDNA library was constructed, and all the 15 primer pairs showed the amplification. Then all the primers available were subjected to PCR for DNAs from 29 Chinese cabbage varieties and 7 primer sets showed polymorphisms, accounting for 46.7% of primers available. Results indicate it is a simp

7、le and effective approach to develop SSR markers based on ESTs.Key words: EST； SSR information Marker development Chinese cabbage简单重复序列（SSR），也叫微卫星（Microsatellites,由于多态信息含量高共显性遗传、技术简单、 重复性好、特异性强等特点，被认为是植物育种中最有用的分子标记系就序列标签（EST）代表生物 体某种组织某一时期的表达基近几年大量快速增长IBT数据已成为SSR的重要来源，各种植物中约有 1-5%的EST含有可用于建立标记的SRu。E

8、ST-SSR与基因表达和基因功能相联系，例如，发现水稻腊质基 因含有CT）n，其长度多态性与直链淀粉含量有关白菜中目前常用的分子标记主要RFLP标记、RAPD标记和AFLP标记等，尽管获得了一些白蒙T， 建立了一批白菜EST-PCR标记，但还没有利用其建立多态性ST-SSR标记的报道。本研究利用现有的白菜 EST资源，对其进行SSR搜寻和分析，建立卫ST-SSR标记，并对它们的多态性作了分析和评价。1材料与方法1.1植物材料和模板NA提取所用29个白菜品种参见表。取幼嫩叶片洗净晾干，液氮中碾磨采用改良的OTAB法4少量提取DNA0表1本实验所用的植物材料Table 1 Plant materi

9、als tested in experiments物种Species数量品种名称来源NumberVarieties testedSource大白菜 11Brassica rapassp.pekinensis小白菜 18Brassica rapa ssp. chinesis自交系爪自交系B、热优2号、早熟 自交系A和B由韩国忠南大学提 5号、10383新、26新、山东四号、蚕供;热优2号、早熟5号、10383. 白菜、长梗白菜、丰抗0、丰抗8026由浙大园艺系提供；其余购于杭州市种子公司GG1、605、38A、矮蒲头、红明青、杭GG1、605、38A由浙大园艺系提供，州油冬儿、上海青、苏州青、高

10、华青梗、其余购于杭州市种子公司四月蔓、香港菜心、矮抗青、黄芽、绿宝2号、矮箕青、上海青菜抗热505、五月慢、热优2号青梗1.2 EST来源本研究所用的EST共计4584条，其中，3011条是NCBI数据库2002年7月前所登记的，分别来自白菜 的根、花芽、黄化苗；另外573条是韩国忠南大学园艺系对白菜自交系叶片cDNA测序得到的氐1.3白菜EST中SSR信息分析利用 RepeatMasker(http:/repeatmasker.org/cgi-bin/WEBRepeatMa|lkU结合人工搜寻对白菜 EST中所含有的SSR进行查找。搜索SSR的标准是:单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四、五和六

11、核苷酸的 最少重复次数分别为8次、6次、5次、4次、4次、3次以上。对二核苷酸、三核苷酸、四、五和六核苷 酸重复基元分为完全重复、不完全重复，并对搜索出的的频率与长度进行统计和分析。1.4 ESWSSR引物设计与合成挑选符合引物设计dEST-SSR使用软件Primer3 (http:/frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/prime r3_www.cg)设计了 15对引物，由上海生工生物技术公司合成预期产物长度一般在100-300bp之间。具 体见表2。表2.对15个白菜EST-SSR设计的引物Table 2 Primers designed to 15 EST-S

12、SRs of Chinese cabbage引物编号Primer code重复基元Repeat motif来源EST编号EST codeTm(C)GC%EST-SSRP001(CTG) 24Num6112400-B0559.8859.5245.0055.00EST-SSRP002(TC) 17Num5112400-A0960.0859.8350.0045.00EST-SSRP003( TC ) 14Num18.121100-A0960.0260.0750.0050.00EST-SSRP004( CAT) 7Num121900-B1160.7259.8545.0045.00EST-SSRP005

13、(CATA) 17Num17.1209-D0660.6159.9360.0055.00EST-SSTP006(TTC) 20Num4111700-F1160.1959.9660.0050.00EST-SSRP007(GA) 38Num6112400-A1259.8959.8950.0055.00EST-SSRP008(GA) 22Num16.1209-B1160.7359.8955.0055.00EST-SSRP009(GAA) 11Num20.121100-B0361.0059.9731.8260.00序列(5t 3) Sequences(5 t 3) AGCTCGTTGGTTCATTTGC

14、T GCAACCACAGTTACAGCAGC ACGATGAATCCAGTCAAGGC TAAAACCCTGTTCGTTTGGG TTTCTCCGCCAAGTAGTGCT GACGGTTACGGAATCGAGAA TGCTTGCAGAAAGACGAACA TTGAGCGTAGGCAGGAAAAT CACGCCTAGCACTGTCTCCT GGACTCGATGTAGGGGTTGA GGCTCCTCGGTTATAGCCTC ACCAGCTTCCATCCATAACG TGGATTAAGACCATCCCGAG AGAAGGAGCTCTTGTGAGCG AGATTACTGGAGAAGCCGCC AGAA

15、GGAGCTCTTGTGAGCG CCAAAACCAATTTTAAATGCGA GGTGGCAGAGGAGAGCATAG(TC) 1660.0345.00EST-SSRP010Num19.121100-E0860.1350.00EST-SSRP011(TTTC) 22Num110120800-G0760.1950.0059.6045.00EST-SSRP012(TCTCC) 23Num3111700-H1160.0045.0060.1245.00EST-SSRP013(GAT) 27Num.81201-F0158.1345.0057.1245.00EST-SSRP014(CCA) 16Num19.121100-E0159.7945.0059.5850.00EST-SSRP015(TCCG) 22BG544428.E231259.5555.0059.9555.00AAACCCCCTCAAAATGTTCCAAGAAACA