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1、实验二十二甲壳素和壳聚糖的制备及测定目的要求(1) 了解和掌握甲壳素和壳聚糖的制备方法。(2) 掌握壳聚糖的测定方法。原理甲壳素(Chitin,译音几丁)又称甲壳质、壳多糖、几丁质等。它是在1811年，被法 国科学家HBraconnot在进行蘑菇研究的，从霉菌发现的。在蟹等硬壳中，含甲壳素15% 20%，碳酸钙75%。甲壳素是聚-2-乙酰胺基-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖，以B - (14)糖苷 键连接而成，是一种线性的高分子多糖，即天然的中性粘多糖。它的分子结构与纤维素有些 相似，基本单位是壳二糖(chitobiose),其结构式如下：甲壳素若经浓碱处理，进行化学修饰去掉乙酰基即得到壳聚糖(Ch
2、itosa)又称脱乙酰 基壳多糖、脱乙酰甲壳素。在一般条件下，甲壳素不能被生物降解，不溶于水和稀酸，也不溶于一般有机溶剂。食 品工业及水产加工地区有大量虾皮、虾头，蟹壳等下脚，可以利用来制备甲壳素和壳聚糖等。 壳聚糖具有广泛的用途：在食品工业上，把壳聚糖在温和的条件下，局部水解后粉碎成末， 得到的壳聚糖产品称为微晶壳聚糖，可用作冷冻食品(冷肴、汤汁、点心)和室温存放食品 (蛋黄、酱等)的增稠剂和稳定剂。用水解方法可以制得纯的N-乙酰氨基葡萄糖。N-乙酰 氨基葡萄糖是肠道中双叉乳酸杆菌的生长因子，因此可作为婴儿食品的保健添加剂。在医药 工业上，由于壳聚糖是类似纤维状的高分子化合物，和生物体有良好
3、的亲和作用，在生物体 内可被分解吸收，所以用它可制作手术线，伤好后线与肉长在一起，可免去拆线之苦；用 它做人造皮肤，植入受伤伤口，可长出新的不带疤痕的表皮；还可用于制作人造血管、人工 肾；用壳聚糖制成的微型胶囊，放入药剂，植入人体内，很容易结合在一起，使药物缓慢地 释放，起到长期治疗的效果；用它还可制成透析膜、超滤膜和脱盐的反渗透膜，与纤维素等 的交联复合体可作为分子筛，用作药物的载体，具有缓释、特效的优点，国外正研究作许多 药物的缓释剂。若以戊二醛等作交联剂，可与许多酶或微生物细胞固定化，如固定化天门冬 酰胺酶；壳聚糖是碱性多糖，有止酸、消炎作用，可抑制胃溃疡；动物实验表明，还可降低 胆固醇
4、、血脂，国外已报道用作心血管系统降低胆固醇的药物；经分子修饰制得肝素类似结 构物，具抗血栓作用。据报道，由壳聚糖可制备抗凝血素，防止凝血酵素原转化为凝血酵素， 抑制血液中纤维蛋白原转变成纤维蛋白而不呈凝血现象。壳聚糖是一种天然高分子螯合物， 用它处理含金属的废水，既可净化污水，又可回收金属，它还可以同具有阳离子的活性泥、 蛋白质及一些固体微粒结合，因此一些肉类加工厂、食品厂和酿酒厂利用它处理废水，使废水排放达到一般标准。在日化工业上，壳聚糖可作为化妆品和护发素的添加剂，增强保护皮 肤、固定发型的作用。在农业上，用壳聚糖处理的植物种子，可以增强抗病虫害的能力，提 高产量。在水果加工中，壳聚糖溶剂
5、可使水果保鲜度延长数月。甲壳素都是与大量的无机盐和壳蛋白紧密在一起的。因此，制备甲壳素主要有脱钙和脱 蛋白两个过程。用稀盐酸漫泡虾、蟹壳，然后再用稀碱液浸泡，将壳中的蛋白质萃取出来 最后剩余部分就是甲壳素。采用不同的方法可以获得不同脱乙酰度的壳聚糖。最简单、最常用的是采用碱性液处理 的脱乙酰方法。即将已制备好的甲壳素用浓的氢氧化钠在较高温度下处理，就可得到脱乙酰 壳多糖。测定甲壳素脱乙酰基的程度，实际上可以通过测定壳聚糖中自由氨基的量来决定。壳聚 糖中自由氨基含量越高，那么脱乙酰程度就越高，反之亦然。壳聚糖中脱乙酰度的大小直接 影响它在稀酸中的溶解能力、黏度、离子交换能力和絮凝能力等，因此壳聚
6、糖的脱乙酰度大 小是产品质量的重要标准。脱乙酰度的测定方法很多，如酸碱滴定法、苦味酸法、水杨醛法 等。本实验采用苦味酸法测定壳聚糖的乙酰度。苦味酸通常用于不溶性高聚物的氨基含量的 测定。在甲醇中苦味酸可以与游离氨基在碱性条件下发生定量反应。同样，苦味酸也可以与 甲壳素和壳聚糖中游离氨基发生反应。由于甲壳素和壳聚糖均不溶于甲醇，而二异丙基乙胺 能与结合到多糖上的苦味酸形成一种可溶于甲醇的盐，这种盐能从多糖上释放出来。该盐在 358 nm的吸光值与其浓度（0115umol/L）呈线性关系。通过光吸收法测定这种盐的浓 度，即可推算出甲壳素和壳聚糖上氨基的数量，进而计算出样品的乙酰度。此法的优点是 适
7、用于从高乙酰度到不含乙酰度的宽范围，无需复杂设备。其样品量只需数毫克至数十毫克。原料、试剂和器材、原料新鲜虾壳。二、试剂1. 10 mol / L苦味酸甲醇液：称取苦味酸（picric acid,又称三硝基苯酚）2290.0g,定 容于1L甲醇液中。0.1 mol/L和0.1 mmol / L苦味酸甲醇液由10 mol / L液稀释得到。2. 0.1 mol/L二异丙基乙胺（DIPEA）甲醇液：称取10.1g二异丙基乙胺定容于1L的 甲醇液中。3. 无水乙醇 这里用于调节pH值，选用分析纯试剂（AR ）4. 甲醇 这里用于调节pH值，选用分析纯试剂（AR ）5. 10%盐酸 这里用于调节pH值
8、，选用化学纯试剂（CP）。6. 40%氢氧化钠。这里用于调节pH值，选用化学纯试剂（CP）。一、器材1 .粉碎机2. 玻璃烧杯2000mLX43. 低温减压干燥机4. 紫外分光光度计5. 层析柱（内径 0.5cmX10cm）6. 抽滤瓶。7. 玻璃试管 16X160mmX108移液管 0.5mLX2、lmLX4、10mLX2甲壳素和壳聚糖 的制备一甲壳素的制备1 操作路线 : - t+ 打一一-甲比比密.，K，i I J：:2 操作步骤1）清洗处理收集对虾头及外壳，去掉枪刺，用水洗净，晒干或烘干，经粉碎机粉碎过 筛得虾头皮粉。2）脱钙 将虾头皮粉倒入玻璃烧杯中，加入25倍量的10%的盐酸，在室
9、温条件下， 搅拌3h,然后抽滤，用水洗滤渣至pH为7.0,干燥后即得脱碳酸盐虾头皮粉3）脱脂将脱碳酸盐虾头皮粉移入另玻璃烧杯内，加入2倍量的4%的氢氧化钠溶液， 加热至85，恒温搅拌34h，然后抽滤，收集滤渣，用水洗滤渣至中性干燥即得甲壳素 粗品。4）酸处理将甲壳素粗品移玻璃烧杯入中，加入23倍的10%的盐酸，加热到60C, 搅拌15min左右，然后抽滤，滤液用水洗至中性，干燥即得甲壳素产品。二壳聚糖的制备1. 工艺流程滋乙Si璧;2. 操作步骤1）脱乙酰基将甲壳素倒入玻璃烧杯中，加入2倍量的40%的浓氢氧化钠溶液，加热 到110C以上，搅拌反应1h,滤除碱液，用水洗至中性。依脱乙酰度的不同要
10、求，重复用浓 碱处理12次，滤除碱液，水洗至中性，压挤至干，吊干产品。2）干燥 将吊干的湿产品置于石灰缸或干燥器中干燥，即得壳聚糖产品。三、壳聚糖的乙酰度测定1 标准曲线的绘制配制五种不同浓度的二异丙基乙胺苦味酸的甲醇溶液。每份吸取0.1mol/L的二异丙基 乙胺甲醇溶液1.0mL，分别添加0.1. 0.2. 0.3. 0.4. 0.5. 0mL的100 u mol / L苦味酸甲醇 液，再用甲醇液补充至10.0mL, DIPEA-苦味酸浓度分别为：10, 20, 30, 40, 50umol/L。 混匀后在波长358nm处测出相应的吸光值（A）。以吸光值为纵坐标,DIPEA-苦味酸的浓度 （
11、umol/L）为横坐标做出标准曲线。2.壳聚糖乙酰度的测定准备一支小玻璃层析柱（内径0.5cmX 10cm）,并精确称重，然后将壳聚糖样品530 mg）粉碎成细末后装填到小层析柱内，再精确称重。两次称量值之差即为样品质量（mg）。 用0.1mol/L二异丙基乙胺的甲醇溶液缓慢流过小层析柱，共用15 m in,再用10 mL，甲 醇液淋洗，除去多糖样品上残留的盐。然后将0.51.0mL的0.1 mol/L苦味酸的甲醇溶液 慢慢地加入柱中，室温下苦味酸与样品中的氨基反应6h，形成苦味酸多糖复合物，接着用 速度为 0.5mLmin 的甲醇液 30 mL 淋洗，使没有结合到氨基上的苦味酸完全被淋洗出来
12、。 再用0.1 mol/L二异丙基乙胺的甲醇液0.51 .OmL缓慢地加入柱内，保持30 min,然后用 约8mL甲醇液淋洗柱子，收集洗脱液，并用甲醇液准确地补足到10 mLo测定收集的可溶性DIPEA-苦味酸甲醇溶液在358 nm的吸光值(必要时作适当稀释)， 根据标准曲线得知其浓度。该甲醇盐溶液摩尔消光系数为15650L/(molcm),也可以利 用此值直接计算出其浓度。3乙酰度的计算根据下式计算出样品的乙酰度(degree of Nacetylation, da)： m161n乙酰度(d. a.)M+42n式中，m为样品质量(mg)； n为从样品上洗脱出来的苦味酸的物质的量(mmol)；
13、 161表 示D-葡萄糖胺残基的摩尔质量(mg/mmol)； 42为N乙酰-D-葡萄糖胺摩尔质量减去D- 葡萄糖胺摩尔质量的差值(mg/mmol)。思考题1. 甲壳素和壳聚糖在化学结构上有何异同点？2. 壳聚糖有何用途？参考文献1. .陈来同， 41 种生物化学产品生产技术， 175181.北京，金盾出版社， 1994.10.2. 王风山，凌沛学，生花药物研究， 357361，人民卫生出版社， 1997.12.3. 单虎，王宝维，张丽等，甲壳素及壳聚糖提取工艺的研究.食品科学， 1997， 18(10)：14154. 卢凤琦，曹宗顺.制备条件对脱乙酰甲壳素性能的影响.化学世界， 1993， 34(3)： 1381405. Neugebauer W A， Neugebauer E and Brzezinski R. Determinat : on of the Degree of Nacetylation and Chitin-chitsan with Picric Acid， Carbohydr Res，1989， 189： 363367
