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1、基因的转录、转录后加工及逆转录转录(transcription是以DNA单链为模板，NTP为原料，在DNA依 赖的RNA聚合酶催化下合成RNA链的过程。与DNA的复制相比， 有很多相同或相似之处，亦有其特点，它们之间的异同可简要示于表 13-1转录的模板是单链DNA，与复制的模板有较多的不同特点，引出了 下列相关概念。转录过程只以基因组DNA中编码RNA (mRNA、 tRNA、rRNA及小RNA)的区段为模板。把DNA分子中能转录出 RNA的区段，称为结构基因(structure gene)。结构基因的双链中， 仅有一股链作为模板转录成RNA，称为模板链(template strand)也称
2、 作 Watson (W)链(Watson strand、负(-)链(minus strand或反意义 链(antisense strand)。与模板链相对应的互补链，其编码区的碱基序列 与mRNA的密码序列相同(仅T、U互换)，称为编码链(coding strand) 也称作 Crick(C)链(Crick strand)、正(+)链(plus strand),或有意 义链(sense strand)。不同基因的模板链与编码链，在DNA分子上并 不是固定在某一股链，这种现象称为不对称转录(asymmetric transcription)。模板链在相同双链的不同单股时，由于转录方向都从5 -
3、3,表观上转录方向相反，如图13-1。与DNA复制类似，转录过程在原核生物和真核生物中所需的酶和相 关因子有所不同，转录过程及转录后的加工修饰亦有差异。下面的讨 论中将分别叙述。参与转录的酶转录酶(transcriptase)是依赖 DNA 的 RNA 聚合酶(DNA dependent RNA polymerase, DDRP)，亦称为 DNA指导的 RNA 聚合酶(DNA directed RNA polymerase),简称为 RNA 聚合酶(RNA pol)。它以 DNA 为模板催化RNA的合成。原核生物和真核生物的转录酶，均能在模板链的转录起始部位，催化 2个游离的NTP形成磷酸二酯
4、键而引发转录的起始，如图13-2所示。 因此，转录的起始不需引物，这也是转录与复制在起始阶段的一大区 别。一、原核生物的RNA聚合酶细菌中只发现一种RNA聚合酶，能催化mRNA, tRNA和rRNA等 的合成，研究得比较清楚的是大肠杆菌 coli)的RNA聚合酶。(一)大肠杆菌RNA聚合酶的组成大肠杆菌RNA聚合酶的分子量约450kDa,由四种5个亚基(a 2卩 卩O ）组成全酶（holoenzyne）, O亚基与全酶疏松结合，在胞内、 外均容易从全酶中解离,解离后的部分（a 2卩卩）称为核心酶（core enzyme）。通过利福霉素等抑制转录的实验研究，对转录酶各亚基的 功能已有一定的认识：
5、a亚基可能参与全酶的组装及全酶识别启动 子，从而决定哪些基因可转录；卩亚基与底物（NTP）及新生RNA 链结合；卩亚基与模板DNA结合；卩和卩亚基组成酶的活性中 心，通过DNA的磷酸基团与核心酶的碱性基团间的非特异性吸附作 用，核心酶能与模板DNA非特异性松驰结合；O亚基的功能是识别 启动子，辩认转录起始点，但不能单独与DNA模板结合，当它与核 心酶结合时，可引起酶构象的改变，从而改变核心酶与DNA结合的 性质，使全酶对转录起始点的亲和力比其他部位高4个数量级，在转 录延长阶段，O亚基与核心酶分离，仅由核心酶参与延长过程。因此， O亚基实际上被认为是一种转录辅助因子，因而称为 O因子（O fa
6、ctor）。（二） O因子生物体在生命周期的不同阶段或在内、外环境有所变化时，其基因表 达有一定的时、空顺序，以适应生长、发育及环境变化的需要RNA 聚合酶的活性是决定基因表达的重要一环。而J因子是RNA聚合酶 识别及结合启动子的亚基，原核生物中所有RNA的转录都由同一种 RNA聚合酶催化，在生命周期的不同阶段或不同环境下，这个酶如 何识别所有转录单位的启动子，是由识别启动子的J因子来完成的。基因启动子-35和-10区的共有序列（图13-3）是O因子识别的位点，如表13-2所示，不同的O因子能识别的共有序列可以完全不同。二、真核生物的RNA聚合酶真核生物的RNA聚合酶已发现有三种，称为RNA聚
7、合酶I、II和III, 分别负责转录不同的RNA,它们对特异性抑制剂鹅膏蕈碱的敏感性 亦有差异，如表13-3所示。第二节转录过程转录是生物合成RNA的过程，与复制相似，有起始、核苷酸链延长 和链合成终止三个阶段。一、转录的起始转录的起始，就是形成转录起始复合物的过程。这一阶段反应所需的 辅助因子，在原核生物与真核生物之间有较大的差异。原核生物转录的起始转录的起始由RNA聚合酶与DNA模板的启动子(promoter)结合。经过对百种以上原核生物不同基因的启动子进行分析,发现启动子具 有下列的共同点：在-10bp处有一段共有序列(consensus sequence), 富含AT,即-TATAAT
8、-,系Pribnow等首先发现，因而称为Pribnow 盒(box),再往上游-35bp的中心处又有一组保守的共有序列，即 -TTGACT-。启动子邻近的结构示如图13-3。结合过程可分为二个步骤，首先由o因子辨认启动子的-35区，全 酶与该区结合，形成疏松的复合物，此时DNA双链未解开，因而称 为封闭型转录起始复合物，继而RNA聚合酶移向-10区及转录起始 点，在- 20区处DNA发生局部解链，形成1217bp的单链区，RNA 聚合酶与DNA结合更紧密，形成开放型转录起始复合物。以单链的 模板链为模板，RNA聚合酶上的起始位点和延仲位点被相应的NTP 占据，聚合酶的卩亚基催化第一个磷酸二酯键
9、的生成，o亚基从全酶 解离，形成DNA-RNA聚合酶(核心酶)结合在一起的起始延仲复合 物。真核生物转录的起始真核生物有三种RNA聚合酶，分别催化不同RNA的合成，每种酶 都需要一些蛋白质辅助因子，称为转录因子(transcription factor,TF。 为方便讨论，转录因子的命名冠以聚合酶的名称。女口RNA聚合酶II 所需的转录因子称为转录因子【(transcription factorll, TFII)。1. RNA聚合酶I催化的转录起始RNA聚合酶I催化前rRNA (40SRNA)的合成。前rRNA基因转录起始点上游有两个顺式作用元件cis acting element), 一个是
10、跨越起始点的核心元件core element),另一 个在- 100bp 处有上游调控元件(upstream control element,UCE)RNA 聚合酶I催化的转录需要2种转录因子，分别称为上游结合因子(upstream binding factor,UBF ) 和选择 性因子 1 ( selective factorl,SLl )。SL1含有4个亚基，一个是 TATA盒结合蛋白(TATA-binding protein,TBP),另 3 个是TBP相关因子(TBP-associated factors,TAF)。UBF与DNA结合令模板DNA发生弯曲，使相距上百 bp的UCE和核
11、心元件靠拢，接着SL1和pol I相继结合到UBF-DNA 复合物上，完成起始复合物的组建开始转录，如图13-4所示。2. RNA聚合酶II催化的转录起始RNA聚合酶II催化各种前体mRNA的合成。研究表明，RNA聚合 酶II催化的转录起始需要较多的转录因子参与。为了便于讨论，它 们的命名是在转录因子II(TFII )后加上大写字母，分别称为TFIIAJ。RNA聚合酶II结合的启动子的特点是，转录起始点上游有三处参与 转录调控的保守序列或称为顺式作用元件。在-90bp处有核心序列 为 GGGCGG 的 GC 盒，-70bp处有共有(consensus)序列为 GGC (T) CAATCT的CA
12、AT盒，-30bp处有共有序列为TATAA (T) AAT的 TATA盒，又称Hogness盒(Hogness box)。转录起始点与原核生物相 似，大多数为A或Go转录起始复合物的组装：如图13-5。3. RNA聚合酶III催化的转录起始RNA聚合酶III催化tRNA, 5S rRNA 和7S rRNA的转录。(1) tRNA基因转录的起始：tRNA基因的转录初产物是tRNA的 前体，经加工后产生多个成熟tRNAo在DNA上的调控序列位于起 始转录位点的下游，称为内部启动子。有二个调控区，分别位于编码 tRNA D-环和环的序列，分别称为A盒和B盒。如图3-6所示。(2) 5S RNA基因转
13、录的起始：5S RNA基因的转录除了需要TFIIIB和TFIIIC外，还需要TFIIIA,首先由TFIIIA结合到起始位点下游8199 bp处（C盒），然后TFIIIC结合到A盒和B盒，继而是类似 tRNA的转录，TFIIIB与TFIIIC作用，和聚合酶III的结合，即可起始 转录。二、转录的延长转录延长阶段发生的反应，在原核生物和真核生物比较相近。总的来 说，一是聚合酶如何向转录起始点下游移动，继续指导核苷酸之间磷 酸二酯键的形成，二是转录区的模板如何形成局部单链区，便于转录。原核生物RNA聚合酶催化转录起始，即核苷酸链中的第一个磷酸二 酯键形成后，。因子从全酶中解离出来，核心酶就能沿DNA
14、分子移 动，真核生物RNA聚合酶不仅需要较多的转录因子来催化起始，而 且转录起始后，酶的移动也靠多种转录因子的共同作用使酶的构象发 生改变来实现，如在TFIIH等作用下，聚合酶IIC端丝氨酸残基的 磷酸化是聚合酶向下游移动的重要因素。在转录延长过程中，DNA双链需解开1020 bp,形成的局部单链区 象一个小泡，故形象地称为转录泡（transcription bubble）。转录泡是 指RNA聚合酶-DNA模板-转录产物RNA结合在一起形成的转录复 合物。为了保持局部的转录泡状态，在RNA聚合酶下游的DNA需 不断解链，可使其下游的DNA （未解开双链部分）越缠越紧，形成 正超螺旋，而其上游D
15、NA变得松驰，产生负超螺旋，需要解旋酶 (gyrase)和拓扑异构酶来消除这些现象，如图13-7。转录起始复合物中，核苷酸之间第一个磷酸二酯键的形成是由第一个 核苷酸的3 -OH与第二个核苷酸的5-磷酸之间脱水而成。第一个 核苷酸常为G,来自GTP的5-三磷酸仍保留，第二个核苷酸的3 -OH仍然游离形成5 pppGpN-OH3。在聚合酶沿模板链的3-5 移动时，可按模板链碱基序列的指引，相应NTP上的a -磷酸可与延 长新链的3 -OH相继形成磷酸二酯键，其3、Y磷酸基脱落生成焦 磷酸后迅速水解，释放的能量进一步推动转录，使新合成的RNA链 沿着5f 3方向逐步延长。在转录局部形成的RNA :
16、 DNA杂化 双链之间的引力比DNA双链的弱(因为杂化双链间存在dA : rU配 对，dA : rU的稳定性比dA：dT的小)，延长中的RNA链的5- 端会被重新形成的DNA双链挤出，使合成中的RNA的5-端游离 于转录复合物。三、转录的终止 原核生物转录的终止原核生物转录的终止有两种主要机制。一种机制是需要蛋白质因子P (Rho)的参与，称为依赖p因子(p factor)的转录终止机制，另一种 机制是在离体系统中观察到，纯化的RNA聚合酶不需要其他蛋白质 因子参与，可使转录终止，称为不依赖p因子的转录终止机制。1依赖p因子的转录终止：p因子是一种分子量为46kDa的蛋白质, 以六聚体为活性形式。依赖P因子的终止位点，未发现有特殊的DNA 序列，但p因子能与转录中的RNA结合。p因子的六聚体被约70 80 nt的RNA包绕，激活p因
