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1、-流式细胞仪检测细胞周期操作步骤取对数生长期的A549细胞，按1106 cells/ mL以1mL接种于100mm培养皿内24h后，进展所需的处理比方加药,照射特定时间后终止培养，进展下一步的实验收集原培养液，洗后的PBS和消化后的细胞，将三者混匀放入15ml离心管中1000rpm离心5min短时低速离心弃上清，用1.5ml预冷PBS，1000rpm离心5min后去除PBS和细胞悬液内的细胞碎片参加1.5ml预冷PBS,在涡旋状态下参加3.5ml无水乙醇，混匀后，于4固定30min,或-20长期保存。1000r/min,离心5min将乙醇吸除，加PBS清洗混匀1000r/min,5min再离心
2、一遍，将残留在细胞上的乙醇除去吸除离心管内PBS，参加200ul PBS和2ul的RNA酶0.25mg/ml(37下孵育30min)参加0.5ml的50ug/ml的PI溶液室温下避光染色30min将离心管内的细胞过滤(300um尼龙网膜)至含有PBS的EP管中PI具有很强的粘附性，容易使细胞聚团，标记EP管提前一天网上预约开机先开仪器后开软件流式细胞仪的构造一般分为5局部：流动室及液流驱动系统；激光光源及光束成形系统；光学系统；信号检测、存贮、显示、分析系统；细胞分选系统。检测前先涡旋使细胞混匀悬浮呈单个细胞，然后插入流式细胞仪上流动室内充满鞘液，细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱液柱与
3、激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光488nm激发光源荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析荧光染料和细胞DNA分子特异性结合，可以检测出细胞周期各时相细胞比例在用第三方软件分析之前，将流式结果按如下所示导出结果分析Modfit软件分析图片拷贝：直接Ctrl+CFlowjo软件分析FCM-DNA 量分析 1 个细胞增殖群时，可将DNA 含量分布组方图分为三局部，即 G0/1、S、G2M。G0/1和G2M 细胞峰的 DNA 分布均为正态分布，S 期可以认为是一个加宽的正态分布检测结果刻录光盘保存关机先关软件后关仪器，关机前需清洗正常细胞DNA含量：2n-4n凋亡细胞：核内DNA断裂，乙醇
4、固定后膜通透性增加，小片段DNA穿膜丧失，胞内DNA含量减少。PI染色后，荧光强度减小而形成一个DNA含量小于2n的分布区亚G1峰。1、纵坐标Cell Number：即计数的有效细胞数； 2、横坐标DNA Content：即DNA含量； 3、G1、G2、S三期在图中已经标示；4、右侧数字含义：Dip G1-53.84% at 55.56，即G1期DNA含量平均值为55.56；53.84%即G1期细胞数占总数的53.84%；Dip G2-5.64% at 107.72，即G2期DNA含量平均值为107.72，5.64%即G2期细胞数占总数的5.64%；Anne*in V-EGFP/PI双染法检测
5、细胞凋亡根本原理：磷脂酰丝氨酸PS能与连接素Anne*in发生特异结合；PI是核酸荧光染料，不能透过正常细胞膜，只能进入已经破损的细胞膜，在嵌入双链DNA后释放红色荧光，荧光强度与PI结合量呈良好的线性关系。正常细胞：膜完整，PS不外翻PI-/Anne*in-凋亡早期：膜完整，PS翻转PI-/Anne*in+凋亡晚期：PS外翻，膜通透性增加PI+/Anne*in+坏死细胞：膜严重破损，PS不外翻PI+/Anne*in+几乎不存在膜构造PI+/Anne*in-实验步骤：取对数生长期的细胞，按1106 cells/ mL以1mL接种于培养皿内24h后，进展所需的处理比方参加药物特定时间后终止培养，
6、进展下一步的实验细胞用0.25%胰酶37消化5min(胰酶消化时间不易过长，以防引起假阳性参加PBS制成细胞悬液移液枪吹打6-8次倒置显微镜下观察细胞状态单个别离悬浮将细胞悬液移入15ml离心管中2000rpm离心5min,PBS吸除用PBS 清洗细胞2次2000rpm，离心5min收集细胞用400ul 1Binding Buffer 悬浮细胞(浓度大约为1106 cells/ml)在细胞悬液中参加5ul Anne*in V-EGFP，轻轻混匀后于2-8避光条件下孵育15 min参加10ul PI 后轻轻混匀,于2-8避光条件下孵育5 min在1 h内用流式细胞仪检测流式细胞仪激发光波长采用E*.= 488nm双波长激发，Em.= 510 nm检测EGFP荧光(FL1 channel)和575 nm的发射波长检测PI。细胞应可分成三个亚群：活细胞仅有很低的荧光强度，凋亡细胞有较强的绿色荧光，坏死细胞包括极晚期凋亡细胞有绿色和红色荧光双重染色。在流式细胞术双参数散点图上左下象限显示活细胞，为Anne*in V-/PI-；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为Anne*in V +/PI+；而右下象限为凋亡细胞，显现Anne*in V +/PI-。. z.
