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1、1 引言1. 1牛血清白蛋白的简介 蛋白质是一类重要的生物大分子,它在生物体占有特别重要的地位,蛋白质和核酸是构成细胞原生质的主要成分,而原生质是生命现象的基础。蛋白质的结构决定了蛋白质的性质和功能,相对于其他蛋白质而言,血清白蛋白的结构并不复杂,血清白蛋白是人和哺乳动物体血浆中含量最丰富的蛋白质,约占血浆总蛋白的60%。它是血液缓冲剂,能维持正常的血液渗透压:并且它还可以存储和转运众多的源性和外源性物质。血清白蛋白是一种重要的蛋白质,在血液中的平均浓度为42g/L有着极其重要的生理功能。另一方面,相对而言,血清白蛋白比较容易分离提纯,可以大量制备。所以,血清白蛋白成为研究蛋白质的理化性质、生
2、物学功能、体代、临床应用和遗传变异等方面的理想蛋白质,从五十年代开始人们对其展开了大量的研究,以期在分子水平上揭示相关生命过程的奥秘。牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基,含有丰富的细胞生长必须的营养成份,具有极为重要的功能。1.提供对维持细胞指数生长的激素,基础培养基中没有或量很少的营养物,以及主要的低分子营养物。2. 提供结合蛋白,能识别维生素、脂类、金属和其他激素等,能结合或调变它们所结合的物质活力。3.有些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合,起到解毒作用。4.是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子来源。5.起酸碱度缓冲液作用。6.提供蛋白酶抑制剂,使在细胞传代时使剩余胰蛋白酶
3、失活,保护细胞不受伤害。在动物血液中,白蛋白分子和其他血液成分共同协调保护红细胞,处于等渗状态,此外,白蛋白分子能运输代产物,保持动物生理状态。牛血清白蛋白产品 是一种用途广泛的生物产品,能配制细胞培养基；配制标准蛋白质试剂盒；借用电泳技术测定未知蛋白质的分子量。BSA产品是血清的稀释剂,是其它蛋白质的稳定剂。配在酶试剂中,BSA 可以保护酶的活性,而不让酶短期失活。用在免疫生化的Elisa 和免疫杂交工作中,BSA 能做非专一性吸附杂质的抑制剂,BSA 产品能联结抗体抗原、受体蛋白,做亲和吸附剂中的手臂 1。牛血清白蛋白是由582个氨基酸残基组成,分子量约为67000,等电点为4.8. BS
4、A支链中含有17个对维系蛋白质空间结构稳定性起重要作用的二硫键,由它们组成八对结构交叉相邻的二硫桥键按物理特性溶解度来分,牛血清白蛋白属于清蛋白,溶于水、稀盐、稀酸及稀碱溶液,能为饱和硫酸按所沉淀。按其生物功能分,其属于转运蛋白;按其形状和大小分,其属于球状蛋白,形状接近于球型或椭球形,疏水的氨基侧链位于分子,亲水的侧链在外面暴露于水溶剂,因此在水中的溶解性非常好。因为蛋白质是两性高分子电解质,主要由疏水性各不相同的20种氨基酸组成。在水溶液中,多肽链中的疏水性氨基酸残基具有向部折叠的趋势,使亲水性氨基酸残基分布在蛋白质立体结构的外表面。即使如此,一般仍有部分疏水性氨基酸残基暴露在外表面,形成
5、疏水区。疏水性氨基酸含量高的蛋白质的疏水区大,疏水性强。因此,蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成的荷电区、亲水区和疏水区构成2。1.2 几种分离方法的比较利用基因工程菌发酵生产蛋白质,料液中含有大量组成复杂的培养基、菌体代产物等,目标蛋白的含量常常不到蛋白质总量的1%。新近发展的亲和色谱具有很高的选择性,但吸附过程的少量杂质非特异性结合使纯化效果大大降低,且能和酶专一结合的配基选择困难。毛细管凝胶电泳也只能分离微量的蛋白质纯品,需要高压电场,无法放大。大多数蛋白质是生物活性物质,溶液的pH值、离子强度的变化都可能使其变性失活,特别是被用作医药、结构研究的蛋白质,不仅要有一定的纯度,产品的活性
6、保持也很重要。反胶团法分离蛋白质,使蛋白质始终处于有水的环境中,不致失活,有机相可循环使用,设备简单、料液预处理简单,不存在膜污染,对于蛋白质分离方法的改进具有重要意义。生物产品的生产费用5090耗费在分离纯化过程中,因此,对这一过程的研究和改进具有重要意义。目前,所采用的生化产品分离方法主要有盐析、沉淀、层析、电泳、高效液相色谱等,它们的共同缺点是连续操作和放大困难。沉淀是物理环境的变化引起溶质的溶解度降低生成固体凝聚物的现象,利用沉淀原理分离蛋白质等生物产物的回收、浓缩和纯化。水溶液中蛋白质的溶解度一般在生理离子强度围最大,而低于或高于此围时溶解度均降低,蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降
7、低、发生沉淀的现象称为盐析,利用盐析沉淀初级纯化的产物中盐含量较高,一般在盐析沉淀后,需进行脱盐处理。层析是根据混合物中,溶质在互不混溶的两相之间分配行为的差别,引起移动速度的不同而进行分离的方法.凝胶过滤层析选择性低,料液处理量小;离子交换层析的变量多,;影响分离特性的因素复杂,难放大;而疏水性相互作用层析应用普遍。电泳是荷电溶质在电场作用下发生定向泳动的现象。电泳分离是利用荷电溶质在电场中泳动速度的差别进行分离的方法。电泳法主要分区带电泳、等电点电泳和等速电泳等。这些电泳法又根据是否使用凝胶载体分为凝胶电泳和自由流电泳。自由流电泳适用于连续分离操作,但分离效果易受对流和扩散的影响,凝胶电泳
8、较自由流电泳的分离度高,但凝胶载体对溶质泳动产生的阻力影响电泳速度,并且耗电量大,处理量小2。高效液相色谱法在抗生素中应用广泛,但分析要求高效柱和高灵敏检测、高速、微量避免生物样品的变质,所以对实验仪器要求严格,容易受试验条件限制,同时成本高产量却不高。1.3 反胶团体系 新近发展起来的反胶团体系使在温和条件下大规模分离生物分子成为可能。反胶团萃取技术具有高选择性、易放大、萃取相可循环利用以及分离和浓缩同步进行等优点,特别适用于蛋白质的分离3,既利用了溶剂萃取的优点,又实现了生物物质的有效分离,作为一种新型的生物分离技术应用于蛋白质、氨基酸及药物、农药等物质的分离分析中,显示了巨大的应用潜力。
9、反胶团萃取技术的发现,是分离技术研究领域的一项突破。该技术应用过程中,较少使用毒性试剂,对人体无害,而且反胶团溶液可反复利用,亲和配体的引入,还可提高目标物的萃取率及分离的选择性4。反胶团是当油相中表面活性剂的浓度超过临界胶束浓度后,其分子在非极性溶剂中自发形成的亲水基向、疏水基向外的具有极性核的多分子聚集体4。反胶团体系由表面活性剂、助溶剂、水和有机溶剂构成。反胶团体系具有如下特征：热力学稳定；自发形成；表面力低小于102m.m-1；透明反胶团的直径小于100nm；比表面大;黏度同普通有机溶剂相仿。反胶团的表面活性剂分子层能够避免蛋白质分子与有机溶剂接触,从而保持蛋白质的活性。反胶团法利用蛋
10、白质等生物物质在水相和反胶团相间分配的不同进行萃取分离。形成反胶团的基本推动力来源于表面活性剂分子的疏水尾之间的疏水相互作用以及亲水头基间的静电和氢键等作用力5。用作形成反胶团溶液的有机溶剂主要有：正辛烷、异辛烷、环己烷、苯、甲苯、氯仿等6。离子型双亲物质在非极性溶剂中不能电离,只能以离子对形式存在,形成反胶团的基本推动力来源于表面活性剂分子的疏水尾之间的疏水相互作用以及亲水头基间的静电和氢键等作用力。由于这些作用力在非极性溶剂的环境中较弱,反胶团形成的推动力小得多,所以形成的反胶团的聚集数也很小,一般在10以下,而且随着表面活性剂浓度的变化而变化,但是,在很宽的浓度围聚集数并无突变,不存在明
11、显的临界胶束浓度,水或其他极性杂质的存在可以大大增加聚集数。一般情况下,在较低的表面活性剂的浓度时,反胶团的形状是封闭的球形或椭圆形。由于形成反胶团的作用力较弱,反胶团的大小容易变化5。 阳离子型反胶团壁带正电荷,蛋白质进入反胶团发生在水相PH低于蛋白质的PI时2,这是一种协同过程,即在宏观两相界面间的表面活性层,同邻近的蛋白质发生静电作用而变形,接着在两相界面形成了包含有蛋白质的反胶束,此反胶束扩散进入有机相中,从而实现了蛋白质的萃取.反胶团萃取的热力学研究主要集中在萃取蛋白质上,根据热力学基本理论,蛋白质从水相萃人反胶团相中,达到平衡状态时系统的Gibbs自由能变化应为最小4。反胶团萃取蛋
12、白质的动力学：萃取过程中,蛋白质在互不相溶的两相间的传递分三步：蛋白质从水溶液主体扩散到界面；在界面形成包容蛋白质的反胶束；含有蛋白质的反胶束在有机相中扩散离开界面7。1.4 表面活性剂 表面力是指作用于液体表面单位长度上使表面收缩的力,它是液体的在性质,其大小主要取决于液体自身和与其接触的另一相物质的种类,从广义上讲,能使体系表面力下降的溶质均可称为表面活性剂,但习惯上只将降低表面力作用较大的一类化合物称为表面活性剂。CTAB是季铵盐型阳离子表面活性剂,在碱性介质中不受影响8。表面活性剂是反胶团萃取的一个关键因素,不同结构的表面活性剂形成的反胶团含水量和性能有很大差别。通常希望所选表面活性剂
13、形成极性核较大的反胶团,且反胶团与蛋白质的作用不应太强,以减少蛋白质的失活。表面活性剂的特点：双亲媒性结构；至少溶于某一相；界面吸附；界面定向；形成胶束；多功能性。工业上所用的阳离子表面活性剂都是有机氮化合物的衍生物。大致分两类:一类是脂肪胺本身,由于在使用过程中能吸收氢质子而生成胺盐；另一类是季铵盐,分子中带正电荷。阳离子表面活性剂很少用于清洗,然而它却具有一些独特的性能和作用。因为很多基质的表面带负电荷,如果用阳离子表面活性剂去清洗,反而会被基质的表面负电荷吸附而起不到清洗作用,但是这种特性可用于抗静电,这主要是由于电性中和的作用。另外,在一定时间可依靠离子的电性作用吸附于基质的表面,而把
14、它的疏水端伸向外部,依靠这种作用产生的特殊用途之一就是用作织物的柔软剂,此外,脂肪胺及季铵盐可定向在细菌半渗透膜与水或空气的界面上,紧密排列的界面分子阻碍了有机体的呼吸或切断了营养物质的来源而致使它死亡,所以阳离子表面活性剂也可用于防霉和杀菌9。表面活性剂是胶体和界面化学中一类重要的有机化合物,这类化合物由非极性的尾链和极性的头基两个部分组成。非极性部分是直链或支链的碳氢或碳氟链,它们与水的亲和力极弱,与油有较强的亲和力,因此称为憎水基或亲油基。极性头基为正、负离子或极性的非离子,它们通过离子-偶极或偶极-偶极作用与水分子强烈相互作用并且是水化的,因此称为亲水基或头基。根据其亲水基的差异,表面
15、活性剂可分为阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂。由于双亲性质,表面活性剂趋向于富集在水/空气界面或油/水界面从而降低水的表面力和油/水界面力,因而具有表面活性.表面活性剂又称为双亲物质、胶体电解质等。构成反胶团的表面活性剂最好具有空间体积较大的疏水基团和体积较小的亲水基团2。利用季铵盐为表面活性剂的反胶团相一般需加入油性醇,如己醇和辛醇,其作用是降低表面活性剂亲水头阳离子间的相互排斥作用2,正辛醇在水中的溶解度低,只有0.05g/100gH2O10,当有机相与水相混合时,正辛醇微溶对萃取后水相吸光度测定的影响降低。实验主要仪器有离心机、紫外可见分光光度计、恒温磁力搅拌器等,离心机是生化实验室及生化工业广泛使用的分离设备。实验室用离心机以离心管式转子离心机为主,离心操作为间歇式。离心分离是利用惯性离心力和物质的沉降系数或浮力密度的不同而进行的一项分离、浓缩或提炼操作,对那些固体颗粒很小或液体黏度很大,过滤速度很慢
