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1、聚合酶链式反应（PCR ）聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR ）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术 之一。典型的 PCR 由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反 应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93 C-94C ）使其变性解成单链；人工 合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合,两个引物在模板上结合的位置决定了 扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72 C将单核苷酸
2、从引物的3端开始掺入，以目的基因为模板从5-3方向延 伸，合成 DNA 的新互补链。PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳 克、微克、毫克级的特异性DNA片段。因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用 于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病 和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途：（1）生成双链 DNA 中的特异序列作为探针；（2）由少量 mR
3、NA 生成 cDNA 文库；（3）从cDNA中克隆某些基因；（4）生成大量 DNA 以进行序列测定；（5）突变的分析；（6）染色体步移；（7）RAPD 、 AFLP 、 RFLP 等 DNA 多态性分析等。一、试剂准备1. DNA 模版2对应目的基因的特异引物3. IOxPCR Buffer4. 2mM dNTPmix :含 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各 2mM5 . Taq 酶二、操作步骤1 在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。IOxPCR buffer5 pl4 pl2 pl2 pl1 pldNTP mix (2mM ) 引物 1 (10pM ) 引物
4、2 (10pM )Taq 酶 ( 2U/pl)DNA 模板(50ng- 1pg/pl)1 pl加 ddH2O 至50 pl视 PCR 仪有无热盖，不加或添加石蜡油。2 调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93 C预变性3-5min，进入循环扩增阶段:93 C 40s 58C 30s f 72C 60s，循环 30-35 次，最后在 72 C 保温 7min。3. 结束反应，PCR产物放置于4C待电泳检测或-20C长期保存。4 PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100pl氯仿进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10pl电 泳检测。三
5、、PCR 反应体系的组成与反应条件的优化PCR反应体系由反应缓冲液（IOxPCR Buffer ）、脱氧核苷三磷酸底物（dNTPmix ）、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、寡聚核苷 酸引物（Primerl，Primer2）、靶序列（DNA模板）五部分组成。各个组份都能影响PCR结果的好坏。1 反应缓冲液：一般随Taq DNA聚合酶供应。标准缓冲液含：50mM KCl ，10mM Tris-HCl （pH8.3室温），1.5mM MgCl2 。 Mg2+ 的浓度对反应的特异性及产量有着显著影响。浓度过高，使反应特异性降低；浓度过低，使产物减少。在各种单核苷酸浓 度为200pM时，Mg2+为1.5m
6、M较合适。若样品中含EDTA或其它螯合物，可适当增加Mg2+的浓度。在高浓度DNA及dNTP 条件下进行反应时，也必须相应调节Mg2+的浓度。据经验，一般以1.5-2mM （终浓度）较好。2 dNTP ：高浓度 dNTP 易产生错误掺入，过高则可能不扩增；但浓度过低，将降低反应产物的产量。 PCR 中常用终浓度为 50-400pM的dNTP。四种脱氧三磷酸核苷酸的浓度应相同，如果其中任何一种的浓度明显不同于其它几种时（偏高或偏低），就 会诱发聚合酶的错误掺入作用，降低合成速度，过早终止延伸反应。此外，dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。因 此， dNTP 的浓度直接影响到反应中
7、起重要作用的 Mg2+ 浓度。3 Taq DNA聚合酶酶：在100pl反应体系中，一般加入2-4U的酶量，足以达到每min延伸1000-4000个核苷酸的掺入速度。 酶量过多将导致产生非特异性产物。但是，不同的公司或不同批次的产品常有很大的差异，由于酶的浓度对PCR反应影响极大， 因此应当作预试验或使用厂家推荐的浓度。当降低反应体积时（如20pl或50pl），般酶的用量仍不小于2U，否则反应效率将 降低。4引物：引物是决定PCR结果的关键，引物设计在PCR反应中极为重要。要保证PCR反应能准确、特异、有效地对模板DNA 进行扩增，通常引物设计要遵循以下几条原则： 引物的长度以15-30bp为宜
8、，一般（G+C ）的含量在45-55%，Tm值高于55 CTm=4（G+C）+2（A+T）。应尽量避免数个嘌 呤或嘧啶的连续排列，碱基的分布应表现出是随机的。 引物的 3端不应与引物内部有互补，避免引物内部形成二级结构，两个引物在3端不应出现同源性，以免形成引物二聚体。 3 端末位碱基在很大程度上影响着Taq酶的延伸效率。两条引物间配对碱基数少于5个，引物自身配对若形成茎环结构，茎的碱基 对数不能超过 3 个由于影响引物设计的因素比较多，现常常利用计算机辅助设计。人工合成的寡聚核苷酸引物需经PAGE或离子交换HPLC进行纯化。引物浓度不宜偏高，浓度过高有两个弊端：一是容易形成引物二聚体（pri
9、mer-dimer），二是当扩增微量靶序列并且起始材料 又比较粗时，容易产生非特异性产物。一般说来，用低浓度引物不仅经济，而且反应特异性也较好。一般用0.25-0.5pM/pl较好。 引物一般用TE配制成较高浓度的母液（约100pM），保存于-20C。使用前取出其中一部分用ddH2O配制成10pM或20pM 的工作液。5 模板：PCR对模板的要求不高，单、双链DNA均可作为PCR的样品。虽然PCR可以用极微量的样品（甚至是来自单一细 胞的DNA ）作为摸板，但为了保证反应的特异性，一般还宜用pg水平的基因组DNA或104拷贝的待扩增片段作为起始材料。 原材料可以是粗制品，某些材料甚至仅需用溶剂
10、一步提取之后即可用于扩增，但混有任何蛋白酶、核酸酶、 Taq DNA 聚合酶抑制 剂以及能结合DNA的蛋白，将可能干扰PCR反应。6 PCR 循环加快，即相对减少变性、复性、延伸的时间，可增加产物的特异性。四、注意事项1. PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。最好设立一个专用的PCR实验室。2纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。3所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。4. PCR试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水，采用0.22pm滤膜过滤除菌或高压灭菌。5试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满
11、意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。6试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。7. PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。RT-PCR PROTOCOL 材料与方法1 材料1.1供试用组织（细胞）1.2主要仪器设备1.3主要试剂1.4工具酶及试剂盒2.实验方法2.1 总RNA提取2.2 RT-PCR 2.3 琼脂糖凝胶电泳材料与方法1. 材料1.1供试用动物组织/细胞1.2 主要仪器设备1.5ml离心管、0.2ml PCR管、高速离心机、510ul加样器、220ul加样器、20200ul加样器、TAKARA PC
12、R 仪、551可见光透射仪1.3 主要试剂RNAlocker、RNAout、RNAsaver、氯仿、异丙醇、75% 乙醇、琼脂糖、SYBRGREEN I 染料。1.4 工具酶及试剂盒TaKaRa One Step RNA PCR Kit2. 方法2.1 RNA提取和纯化估算RNAout、组织或细胞的用量。取组织或细胞后，将剩余的组织或细胞放入RNAlocker中保存以备下次使用。将组织或细胞 匀浆后，加入1.5ml离心管。加入0.2倍RNAOUT 体积的氯仿，振荡混匀30秒。室温离心15000g 3分钟。将上清液转移到另 一干净离心管中。在上清液中加入等体积的异丙醇，振荡器上振荡混均30秒。室
13、温离心15000g 5分钟，RNA沉淀将在离心底的 侧面形成，小心吸弃上清液。清洗：在含RNA沉淀的离心管中加入1毫升75%乙醇，振荡器上振荡混均30秒。室温离心15000g,1分钟。小心吸弃上清液。重复清洗步骤。将离心管倒置于滤纸上以干燥RNA。加DEPC水使RNA沉淀溶解，剩余的RNA沉淀使用RNAsaver溶解以备下次使用。2.2 RT-PCR2.2.1 取 TaKaRa One Step RNA PCR Kit，按下列组成配制 RT-PCR 反应液。10xOne Step RNA PCR Buffer5plMgCl2(25mM)10pldNTP Mixture(10mM)5plRnas
14、e lnhibitor(40U/pl)1plAMV RTase XL( 5U/pl)1plAMV-Optimized Taq(5U/ul)1pl上游特异性引物（20pM）1pl下游特异性引物（20pM）1plPositive Control RN或实验样品(1pg total RNA) *1plRnase Free dH2O24plTotal*当目的RNA的表达数量较少时,50pl/Sample可加至25pl。同时在反应体系中相应地应叫少Rnase Free dH2O的量。2.2.2按以下条件进行RT-PCR反应。50 C30minRT反应94 C 30sec37C65 C30sec72 Cl
15、10minPCR反应2530循环当RNA为 PositiveControl RNA寸，反应条件如下。50 C15minRT反应94 C2minRTase失活94 C30sec60 C30sec72 C1.5min2530循环2.2.3反应结束后，取PCR反应液(5 10 l)进行琼脂糖凝胶电泳，确认RT-PCR反应产物。如果此PCR产物需用于以后实验，应将PCR产物冷冻保存。Control反应时扩增片段大小为462 bp。2.3 RT-PCR产物确认电泳后，将SYBRGREEN I染色的凝胶用可见光透射仪观察结果，确认RT-PCR产物。问题可能原因建议解决方法RT-PCR 灵敏 度：在琼脂糖凝 胶分析中看到少 量或没有
