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1、Hans Journal of Biomedicine 生物医学 , 2016, 6(4, 25-30 Published Online October 2016 in Hans.文章引用 : 黄尚谕 , 史青茹 . 唾液酸转运体蛋白 NanT 的分子克隆,异源表达及 纯化 J. 生物医学 , 2016, 6(4: 25-30.Molecular Cloning, Heterologous Expression, and Purification of the Sialic Acid Transporter NanTShangyu Huang1,2, Qingru Shi1*1Youth Sc
2、ience and Technology Guide Station of Baoshan District, Shanghai 2Shanghai Xingzhi High School, Shanghai Received: Sep. 21st , 2016; accepted: Oct. 7th , 2016; published: Oct. 10th , 2016Copyright 2016 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution I
3、nternational License (CC BY.AbstractSialic acids are nine-carbon sugar acids, and are found widely distributed in animal tissues. In human, the brain contains high concentration of sialic acids, which are vital for neural transmis-sion. The transport of sialic acids in vivo is carried out by the mul
4、ti-pass membrane protein, NanT, a membrane of the SLC17 transporter family. The loss of function of NanT will cause salla disease and infantile sialic acid storage disorder.However, the structure and mechanism of the sialic acids transporter remain unknown. In this study, we clone and express the Na
5、nT protein. Combining the affinity and sizeexclusion chromatography, we obtain the high purity of the target protein. Our results provide a basis for further exploring the structure and mechanism of the sialic acids transporter, NanT. KeywordsSialic Acid, Transporter, Neural Transmission, Salla Dise
6、ase唾液酸转运体蛋白 NanT 的分子克隆,异源表达及纯化黄尚谕 1,2,史青茹 1*Open Access*通讯作者。黄尚谕,史青茹1上海市宝山区青少年科学技术指导站,上海2 上海市行知中学 , 上海收稿日期:2016年 9月 21日;录用日期:2016年 10月 7日;发布日期:2016年 10 月 10 日摘要唾液酸是一种含有九个碳的单糖的衍生物。广泛的存在于动物体的组织内。尤 其是人类的大脑,含有高 浓度的唾液酸。这些唾液酸被认为是神经节苷脂的传递递 质,对神经传导具有重要意义。唾液酸在体内 生物膜上的转运是由一种具有多个跨 膜螺旋的膜蛋白NanT介导的。NanT蛋白是SLC17家族
7、转运体蛋白的一员，它的 功能丧失会导致扎拉疾病以及婴儿唾液酸积累紊乱。然而唾液酸转运体蛋白的结构 以及其底物转运机制目前都是未知的。在这篇文章中，我们克隆并表达了 NanT蛋 白。结合亲和层析以及凝胶阻滞层析等手段,我们获得了高纯度的NanT目的蛋 白。我们的结果为进一步研究NanT的结构以及其底物转运机制提供了很好的基 础。关键词唾液酸,转运体,神经传递,扎拉病1. 引言脊椎动物的细胞表面修饰着大量的复杂的糖链,这些糖链主要锚定在膜蛋白以 及磷脂表面。唾液酸是一种含有九碳单糖骨架的化合物,通常分布在糖链的最外端 1-3。 由于唾液酸的定位特殊性及广泛存 在性,它通常介导或调控一些重要的生 理
8、和病理过程。例如,大量的唾液酸分布在人类血红细胞的表面,可以使血红细胞带 有负电性,从而获得电荷排斥效果,在血液环境中这种能力能够阻碍一些非特异的细 胞间的相互作用 4-6。 另外,大量的唾液酸存在于肾小球基底膜以及足细胞的足 突上对维持机体的渗透 功能具有重要作用 78。伸展的寡聚唾液酸链还会影响神 经细胞的可塑性 9-12。在病理条件下,唾液酸还是影响循环通路中一些糖蛋白半 衰期的重要因子,如果唾液酸缺失,潜在的单糖例如半乳糖会被 肝脏或其它器官中的 受体识别,这样糖蛋白就会被快速的降解清除 1314。 因此,研究唾液酸转运体蛋 白具备重要的生物学意义。2. 材料与方法2.1. 唾液酸转运
9、体蛋白NanT的基因克隆及表达质粒的构建2.1.1. 基因扩增通过聚合酶链式反应（PCR,我们从大肠杆菌菌液中获得了唾液酸转运体蛋白 NanT 的基因。通过软 件 Primer Premier 5.0,遵循引物设计的基本原则,我们设计了 如下引物 （黑体部分表示酶切位点,引物由 英骏公司合成 :F: 5-GGCGCGCATATG AGTACTACAACCCAGAATATCC-3R: 5-GACGACTCGAG TTAACTTTTGGTTTTGACTAAATCG-32.1.2. PCR产物的回收，酶切与连接通过琼脂糖凝胶电泳我们分离并检测PCR目标产物条带，然后进行目的条带切 胶回收（TIANG
10、EN胶黄尚谕,史青茹回收试剂盒。PCR回收的目标产物与载体P22b分别用Ndel和Xhol （Takara 公司进行双酶切。酶切反应在37C恒温水浴锅中进行，反应时间为4小时。酶切 后的产物通过回收后，将PCR酶切产物与酶切好的载体进行连接反应（Takara公司 Solution I试剂盒。连接条件为恒温水浴锅10小时。2.1.3. 连接产物转化取出DH5a感受细胞（-80C冻存置于冰上10 min使其解冻。然后将连接产 物全部加入感受态细胞中，冰上放置30 min, 42 C恒温水浴锅中热激90 s,冰上再放 置5 min。在超净工作台中加入200 pl LB培养基。37C摇床培养（200
11、rpm 40 min 后把菌液均匀涂布在含氨苄抗生素的固体LB培养平板上,37C培养箱中过夜培 养。2.1.4. 抽提质粒并进行阳性筛选取出培养箱中的平板，挑取5个单菌落于5 ml含有氨苄抗性的LB培养基小管 中，然后置于摇床中，37C, 220 rpm培养12小时左右。提取质粒步骤按照质粒小抽试剂盒中的步骤 (天根。抽提后的质粒按照基因扩增的 PCR 程序进行阳性筛选,筛 选后的阳性克隆进行保菌并测序。2.2. 唾液酸转运体蛋白 NanT 的表达与纯化2.2.1. 转化BL21菌株并进行大量培养将测序正确的质粒转化大肠杆菌BL21表达菌株,37C培养箱培养过夜后，挑取 单菌落于6 ml含有氨
12、苄抗性的LB培养基小管中，然后置于摇床中,37C, 220 rpm 培养12小时左右。继续培养扩大到6瓶(1.5 L/瓶LB培养基中，37C, 220 rpm培养 至OD600 = 0.8左右。摇床降温到16C,加入1 mM的IPTG进行诱导表达,220 rpm继续培养20个小时。离心机6000 rpm离心8 min收集大肠杆菌，然后将收集后 的菌体用binding buffer (20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl重悬，把重悬液倒至铁 制烧杯中,利用超声 破碎方法对其进行破碎。超声破碎仪参数设置为工作时间 5 min,工作2 s,间歇4 s,功率42%。破碎后的样
13、品按照1.5%加入去垢剂DDM。置于 旋转仪室温进行融膜。3 h后，18,000 rpm离心40 min取上清。2.2.2. NanT蛋白的亲和层析我们首先采用Ni 2+亲和层析柱(NTA进行蛋白纯化，先用binding buffer (20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM DDM平衡柱子，然后把离心上清液缓慢流 经柱子。上样完成后，用binding buffer冲洗柱子20个柱体积,然后用washing buffer (20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM DDM, 20 mM iminazole 洗脱 10 个柱体
14、 积去除杂蛋白。 最后用 elution buffer (20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM DDM, 300 mM iminazole 洗脱目的蛋白。2.2.3. NanT蛋白的凝胶阻滞层析收集的目的蛋白液用浓缩管(milipore浓缩至1 ml，加入30卩1 TEV酶进行柱上 过夜酶切来除去组氨酸标签，酶切产物用Superdex200 (GE Healthcare分子筛柱子 进行进一步纯化，缓冲液为20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM DDM，流速为 0.5 ml/min,最后用SDS-PAGE鉴定蛋白纯度。3.
15、 结果与讨论3.1. nanT 基因扩增我们以大肠杆菌BL21菌株为模板，通过PCR反应，获得了全长NanT蛋白（496 个氨基酸残基,共 1 488个碱基对 的编码基因,并通过琼脂糖凝胶电泳进行分离检测 （图1 , DNA扩增片段在DNA marker 1000 bp2000 bp之间，约1500 bp符合预期。黄尚谕，史青茹3.2. NanT蛋白的表达纯化通过Ni 2+亲和层析柱我们对NanT蛋白进行了初步的纯化,然后用 Superdex200 （GE Healthcare分子筛柱子进行进一步纯化，最后通过SDS-PAGE电 泳检测蛋白纯度 （图 2 ，同时我们进行多次水平实验，确定纯化提
16、取到的蛋白为目标 蛋白。3.3. 研究NanT蛋白转运唾液酸机制的生物学意义在体内，唾液酸含量的改变可以体现很多的病理学特征。在临床病理上，体液唾 液酸水平的检测可 以用于疾病的预测。 现在很多的学术论文都建议通过检查血液 中的唾液酸含量来检测疾病 15-18。 内皮细胞腔表面含有高浓度的唾液酸含量， 它的一个重要功能是供淋巴细胞的L-选择素识别19。相反，活化的内皮细胞表达 E-选择素和P-选择素，它们能够识别淋巴细胞表面的唾液酸。这些选择素介导的相 互作用介导了很多重要的生命过程，包括炎症，淋巴细胞循环，血液凝固，再灌注损伤 19 20 。低浓度脂蛋白上的唾液酸对于内皮细胞磷脂的摄取起到重要作用，因此 与动脉粥样硬化疾病密切相关 21-23。 人类的大脑里面
