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1、农杆菌介导的ZmHSD基因转化玉米自交系糖皮质激素是一类动物激素， 参与糖、 脂肪和蛋白质的生物合成和代谢等过程，还具有抗炎的作用1 o 11 B-羟基类固醇脱 氢酶（11 B -hydroxysteroid dehydrogenase , 11 B -HS。是调 节糖皮质激素的关键酶， 它促进活性糖皮质激素与非活性激素之间的相互转换2 ,3。虽然目前在植物中还没有鉴定出11 B -HSD,但是随着拟南芥基因组测序工作的完成，发现了八个类似HSD 勺基因。最先鉴定出的是一种油菜籽HSD它在利用ABA类似物抑制种子萌发的过程中过量表达4 ； Jolivet 等 5 证实在芝麻和油料作物中只存在微
2、量的 HSD这些HSDS码的蛋白表现出与 NADP所依赖的11 B -HSD 17 B -HSD/17 B -类固醇脱氢酶相同的 性能6 o AtHSD1基因包括6个外显子和5个内含子，它编码的 蛋白由389个氨基酸组成，李凤玲等7将AtHSD1的cDNA连接 到 35S 启动子后整合到拟南芥中，发现转基因植株明显比野生株粗壮，其分支和长角果的数量也明显增多，转 AtHSD1基因植株 的表型与过量产生BR或过量表达BR受体基因BRI1的表型一致 810;同时发现转基因植株的抗盐性比野生植株高 7。因此, 该基因在改善农作物植株生长、提高产量方面有很大的潜力。本研究利用农杆菌介导的遗传转化方法，
3、尝试将 ZmHSD基 因转入玉米自交系品种， 以期获得转基因玉米植株， 拓宽玉米种 质的遗传背景，为高产稳产玉米品种的选育服务。1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 植物材料玉米（ Zea maysL. ）自交系 18-599 、齐 319 和昌 7-2 。1.1.2 目的基因、载体、菌株 ZmHSD表达载体由山东农业大学生命科学学院基因工程实验室构建。 表达载体中， 目的基因为ZmHSD,1具启动子为Ubi ;筛选标记基因为 NPTH ,其启动子 为CaMV35S图1）。本研究所用质粒为 PZP211,大肠杆菌菌株 为DH5a ,农杆菌菌株为 LBA44041.2 试验方法1.2.1 培
4、养基在N6改良培养基11的基础上，添加 0.25 mg/L Na2MnO3 0.025 mg/L CuSO4 5H2O 和 0.025 mg/L CoCl2 6H2O1.2.2 幼胚愈伤组织受体系统参照孙庆泉等11 的方法，取幼胚接种于诱导培养基上，2425c暗培养，继代，选择诱n型 愈伤组织为转化受体。1.2.3 农杆菌介导的遗传转化农杆菌的培养与活化：将低温保存的农杆菌菌种LBA4404接种到添加25 mg/L Spe的YEB固体培养基平板上，挑取单菌落 接种于含 25 mg/L Spe 的 YEB 液体培养基中，置于摇床上预活 化（ 28， 200 r/min ），取预活化的菌液培养至对
5、数生长期备 用。愈伤组织浸染： 浸染前将新培养的菌液离心沉淀菌体， 用液体N6培养基重悬，并稀释到所需OD直。将n型愈伤组织分离成米粒大小的小块， 投放到稀释好的菌液中浸染。 用灭菌的滤纸吸干愈伤表面的菌液， 并将其摆放到共培养培养基上暗培养3 d ，用头孢水洗菌。将洗好的愈伤放到恢复培养基上恢复培养。抗性愈伤的筛选、 分化和再生： 恢复培养后的愈伤组织依次转移到 1 次、 2 次、 3 次筛选培养基上，进行抗性筛选，筛选剂为巴龙霉素。将筛选后存活的愈伤转到分化培养基上分化成苗。分化苗苗高45 cm时转到生根壮苗培养基上。当苗适度生根后转到基质（基质：蛭石=1 ： 1）中。成活植株转到大田隔离
6、 区。1.2.4 转基因植株的PCR佥测CTA砒提取基因组DNA对转化植株、阳性对照（质粒）和阴性对照（未转化植株）进行PCR检测，检测对象为目的基因 ZmHSD和标记基因NPTHo根据已知的ZmHSDl因序歹U,利用primer premier 5.0软件设计ZmHSDI的引物，上游引物在启动子内部，下游引物在编码区内，S：CACGATTCTTCCTCGGCTC，CTAC：T TGCTACTCCTTCCTTTCCTG； GCT 标记基因 NPTI 的引物为 S: GTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTG agctcttcagcaatatcacgggTAGC上海生工生物工程公司合成
7、。用25皿PCR&应体系。扩增反应程序：94c预变性5 min；94变性1 min ， 59退火50 s ， 72延伸50 s ， 35 个循环；72c终延伸10 min ； 4c保存。1须脂糖凝胶、1%TBEt泳缓冲液电泳，溴化乙锭染色，紫外分析，拍照。2 结果与分析2.1 转基因植株的获得将玉米幼胚（授粉后1015 d）接种于诱导培养基上，诱导出胚性愈伤组织（图 2-1 ， 2-2 ， 2-3 ）；将经农杆菌浸染后的愈伤（图 2-4 ），恢复培养1 周，愈伤组织生长状态有所改善，转入筛选培养基筛选，1 轮后有些愈伤开始变褐，3 轮后大部分未转化愈伤褐化死亡，愈伤组织上出现的小块鲜活愈伤组织
8、突起基本上为抗性愈伤，抗性愈伤在筛选培养基上生长正常 （图2-5 ） ； 将经过 3 轮筛选的愈伤转到分化培养基上光照培养， 25 d后愈伤表面开始出现绿色芽点， 之后绿色芽点逐渐分化成巴龙抗性苗（图 2-6 ）；将幼苗转到生根壮苗培养基上（图 2-7 ），使苗生根，期间有少量白化苗出现；待苗长出23条根、高约1015 cm 时，打开封口膜，炼苗5 d 后移栽花盆 （图 2-8）； 3周后移栽转基因隔离区，开花期进行人工自交结实（图 2-9 ）；最终获得转基因种子（图 2-10 ）。2.2 转基因植株分子检测2.2.1 目的基因ZmHSD的PCR佥测利用ZmHSD引物对抗性苗基因组DNA3彳f
9、 PCR佥测，有33株抗性苗出现与阳性对照一致的 444 bp 的特异性扩增条带（图3），表明该33 株转基因植株已将外源基因整合到基因组中。2.2.2 标记基因NPT II的PCR佥测对已知阳性转基因植株的基因组DNA4行标记基因NPT II的PCRT增，均得到与阳性对照一致的 650 bp 的特异性扩增条带（图4），表明目的基因PCR检测的阳性株也全为标记基因阳性株。 对标记基因的检测可以排除玉米基因组中ZmHSD基因的干扰。3 结论3 个供试玉米自交系 18-599 、 齐 319 和昌 7-2 的幼胚都能诱导产生n型愈伤组织，其中18-599所获愈伤组织质量好、数量多，适于大量转化；齐319 和昌 7-2 愈伤颗粒松散、质量不高，尤其是昌 7-2 ，胚性愈伤数量较少。经农杆菌转化共得到899株转化株，通过PCR佥测初步证明有 33 株为阳性转化植株， 其中 18-599 有 686 株转化株， 阳性株21 株，转化效率为3.06%；齐319有 183 株转化株，阳性株10株，转化率为5.46%；昌7-2 有 30株转化株，阳性株2 株，转化率为 6.67%。最终获得ZmHSD转基因玉米T1代种子，为玉米优良品种的 选育奠定了基础。
