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1、四、三種不同性質蛋白質跑出來的結果:左圖(Fig. 14-a)之電泳圖為未使用SDS處理之三樣本X,Y, Z所跑出的結果，分子量及淨電荷密度均影 響泳動率，三樣本原本之電性都未改變，由於電泳方向設定為帶負電之樣本由負極跑向正極，Z反而向上方之正極趨近，因其帶正電，所以膠體上看不到Z的帶，而X由四小集團組成之分子大於Y，所以Y會跑的較遠而較接近正極，因大分子阻力較大。右圖(Fig. 14-b)為以SDS處理後之樣本所跑出的電泳圖，只有分子量影響泳動率，三樣本皆帶負電，往正極移動，且SDS會解開蛋白質之folding結構，SDS-PAGE又有加入B -mercaptoethano,其會打斷 pep
2、tide間之雙硫鍵，故樣本都是以簡單polypeptide形式去電泳，X被分成四小單元故最小而跑最遠，但 跑樣本X之跑道上有出現一小帶，其為處理不完全之 X樣本，其還是tetramer，最大故最接近負極，Z最 小所以跑最遠而最接近正極。Fig. 14 Native-PAGE （b） SDS-PAGEX 為 tetramer （分子量:40000 4），Y（分子量:88000）、Z（分子量:60000）為 monomer； pH8.3 之情況下：NATIVE PAGE （X，Y帶負電；Z帶正電）;SDS-PAGE （皆帶負電 ）判讀SDS-PAGE結果數據：內插法作圖kDa330220kDaMi
3、gration (R f)3618.567609467433020.114.4Fig. 15單元體分子量的測定(SDS-PAGE)，由電泳結果之樣本移動距離依內插法作一線性圖求分子量。X軸：分子量(kDa) 丫軸：泳動率(Rf)五、蛋白質染色法及原理:根據結構之特徵(Fig. 16)，即因含有特定side chain而和染劑產生作用，故達到染色效果, 有兩種方法，第一種方法：將硝酸銀溶於硝酸溶液中，產生銀氨錯離子，用此可 染蛋白質中含有Lys部分，銀離子會還原成金屬銀而附著在Lys之side chain上,產生深褐色反應產物。第二種方法：使用coomassie blue R (red)調整其p
4、H值，使其呈藍色，可染Lys及Arg之side chain部分，而達到染色效果。金屬銀沉澱Ammon iacalsilver+ AgNH2更G l u *NHC C(Cys)還H2NAg還原+HqN. Ag.NH33LysSO-+ SO3N H3CCoomassieBlue RFig. 16兩種主要蛋白質染色法:N = NOHSO3NHSO3OORCRORO+ HCCCHG lutaraldehyde1. Ammo ni acal silverR3Arg +n h 2HNC NH2CcH COHOONHSO3N = NOHC OH RR SC2. Coomassie blue R六、電泳膠體蛋
5、白質的溶離：使用little blue tank直接挖出膠體進行溶離或定序(Fig. 17-a)，使用little blue tank進行電泳(Fig. 17-b)，將溶離出之樣本經 通電後會集中在tank端，有助於吸出並收集(Fig. 17-c)。(b)(c)Fig. 17 (a)將有色帶呈現之膠體部分挖岀並收集在溶離槽內 代表電泳泳動聚集方向(b) little blue tank (c)通電進行電泳前(上卜後(下)之情況，箭頭七、電泳槽及相關設備r(a)(b)(c)Fig. 18 (a)電泳槽(左)、鑄膠器(右)(b)轉印三明治(左)、轉印槽(中，右)(c)供電器一般電泳使用迷你電泳槽，
6、而SDS-PAGE使用其專用之電泳槽肆：免疫轉印法通電使膠體上之色帶轉印至nitrocellulose上(Fig. 19-a)，先以ponceau染nitrocellulose,確定轉印是否成功，有紅色色帶呈現即表示轉印成功，在以清水洗淨，進而已抗體偵測呈色(Fig. 19-b)。(a)GeONitrocellulose(b)電泳膠體CoomassieBlueStai ningFig. 19轉印三明治，箭頭代表轉印方向(gel f nitrocellulos) (b)轉印轉印紙PonceauStai ning免疫染色流程抗體偵測呈色利用抗原抗體結合之原理，原本使用放射線標定於抗體上，後來改為使
7、用酵素，先由一級抗體和轉印 紙上的特定抗原結合，此抗原即是要找之peptide, 一級抗體可自行製備，通常選擇異源性且分子量上萬之蛋白質去引發抗體產生而可作為一級抗體，再使用一抗一級抗體之二及抗體去和一級抗體結合， 其上已標定好酵素，但若先標定一 biotin則可達到放大信息的效果，因biotin和streptavidin有很強之結合力，其解離常數為10-20，而streptavidi n又能再和另三個biotin結合，此三個biot in尚在各自接一 酵素，可放大信息三倍，有時二及抗體上會標定金屬，如：金 (Fig. 20-b)，抗體抗原之專一性結合完畢 後，加入受質作用，受酵素催化行程不溶
8、性產物而堆積在酵素作用周圍，就能顯示欲找之樣本所在(Fig.20-c)。免疫轉印法之靈敏度比硝酸銀染色法高。(a)(b)(c)Au2eP pP P P2質生成物Fig. 20免疫轉印之選用專一性組合單元，及(b)種類，與(c)呈色機制p p p pFig. 20免疫轉印之選用專一性組合單元，及(b)種類，與(c)呈色機制等電焦集法:蛋白質之帶電性會隨著環境pH而改變，當處於等電點時，其靜電荷為零，故在電泳時會停止移動，利 用此原理能進行等電焦集法進而達到分離之目的(Fig. 21)。+ + +Fig. 21 pl值為7之蛋白質進行等電焦集電泳，當泳動至pH值為7之環境時會停止移動蛋白質在低於其
9、靜電荷為正；若在高於其 pl值之環境下其靜電荷為負pl值之環境下，其伍：Proteomics一、組合不同數目胺基與酸基可合成多種pl的混合物：商業上之應用藉由控制分子上正負電性基團之數目而造成多種pl之混合物。第一次元先進行等電焦集電泳於一長條平面上，接著再進行第二次元之 SDS PAGE電泳，即先將樣本 以等電不同之特性先分離，在進行和等電焦集電泳方向垂直之 SDS PAGE電泳，利用分子大小不同作 進一部區分(Fig. 22)。Isoelectric Poi ntpH4567kD 100i 50I25I 3 ISDSPAGESDS-PAGE依分子大小不同將蛋白質Fig. 22二次元電泳：橫
10、向利用等電焦集法依等電點將蛋白質初步分離，接著縱向利用 進行進一步分離MALDI-TOFMass spectrumGCGDatabase searchi ngAmi noacidseque ncingCapillaryElectrophoresisHPLC二、蛋白質體綜觀蛋白質的消長與身分：將樣本進行2D電泳，從膠體中挖出欲分析之部分，將其中之蛋白質溶離並用酵素切成小片段，接著將 這些小片段分兩路進行不同分析，一方面進行MALDI-TOF質譜儀分析得各小片段之分子量；另一方面以HPLC依極性不同進行分離，將小片段隻胺基酸進行由N-端至C-端之定序，最後將所得隻小片段資料，包括分子量及序列，進入現有蛋白質資量庫進行比對，最終目的是要求出是什麼蛋白質(Fig. 23)2D electrophoresispPure proteinProteolytic fragme ntsFig. 23蛋白質種類分析之步驟流程
