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1、LoWry法与劳里法测定植物体内可溶性蛋白质含量一、原理LoWry法是双缩脲法（BIureT）和福林酚法（Folin-酚）的结合与发展。其原理是蛋白质溶液用碱性铜溶液处理后，碱性铜试剂与蛋白质中的肽键作用产生双缩脲反应，形成铜蛋白质的络合盐。再加入酚试剂后，在碱性条件下，这种被作用的蛋白质上的酚类基团极不稳定，很容易还原酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸（PHosPHoMolyBdATe&PHosPHoTungsTATe），使之生成磷钨蓝和磷钼蓝的混合物。这种溶液蓝色的深浅与蛋白的含量成正相关，所以可以用于蛋白质含量的测定。LoWry法除使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外，还使双缩脲法中肽键的显色
2、效果更强烈，其显色效果比单独使用酚试剂强315倍，约是双缩脲法的100倍。由于肽键显色效果增强，从而减少了因蛋白质种类不同引起的偏差。LoWry法适于微量蛋白的测定，对多个样品同时测定较为方便。但对不溶性蛋白和膜结合蛋白必须进行预处理（如加入少量的SDS）。1. 双缩脲法的原理双缩脲（NH2-C0-NH-C0-NH2）在碱性溶液中可与铜离子产生紫红色的络合物，这一反应称为双缩脲反应。因为蛋白质中有多个肽键，也能与铜离子发生双缩脲反应，且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关，所以可用双缩脲法测定蛋白质的含量。双缩脲反应主要涉及肽键，因此受蛋白质
3、特异性影响较小。且使用试剂价廉易得，操作简便，可测定的范围为l10mg蛋白质，适于精度要求不太高的蛋白质含量的测定，能测出的蛋白质含量须在约0.5mg以上。双缩脲法的缺点是灵敏度差、所需样品量大。干扰此测定的物质包括在性质上是氨基酸或肽的缓冲液，如Tris缓冲液，因为它们产生阳性呈色反应，铜离子也容易被还原，有时出现红色沉淀。2. 福林-酚法的原理该方法是双缩脲法的发展，包括两步反应：（1）在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质铜络合物。（2）此络合物将试剂磷钼酸一磷钨酸（Folin试剂）还原，混合物深蓝色（磷钼蓝和磷钨蓝混合物），颜色深浅与蛋白质含量成正比。此方法操作简便，灵敏度比双缩脲法高
4、100倍，定量范围为5100ug蛋白质。Folin试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物，均有干扰作用。此方法的缺点是有蛋白质的特异性影响，即不同蛋白质因络氨酸、色氨酸含量的不同而使显色强度稍有不同，标准曲线也不是严格的直线形式。二、仪器与用具试管若干；刻度移液管0.5ml1支，1ml1支，10ml1支；定量加样器；圆底烧瓶；冷凝管1套（带橡胶管）；微量滴定管；小烧杯；微量进样器50ul1支；721分光光度计；恒温水浴器；研钵；玻棒；离心机；离心管。三、试剂Na2WO42H20；Na2Mo042H20；85%H3P04；浓HCl；Li2S04H20
5、；溴水；酚酞指示剂；Na2CO3；NAOH；CuSO45H2O；酒石酸钾钠；牛血清白蛋白。所用试剂均为化学纯或分析纯。1. 四、方法试剂的配制(1) 碱性铜试剂(相当于双缩脲试剂)的制备首先配制A液：4%碳酸钠(Na2CO3)溶液与0.2Mol/L氢氧化钠(NaOH)溶液等比例混合(2%Na2CO3,O.lmolNAOH)；B液：1%硫酸铜(CuSO45H2O)溶液与2%酒石酸钾钠溶液等比例混合(0.5%CuS045H2O,0.1%酒石酸钾钠)。在使用前将A液与B液按50：1的比例混合即成。此为Folin酚试剂甲液，此试剂只能使用1天。酚试剂(相当于Folin试剂)的配备：称取钨酸钠(Na2W
6、042H2O)100g、钼酸钠(Na2MoO42H2O)25g，加蒸馏水700ml溶解于1500M1的圆底烧瓶中。之后加入85%的H3P0450ml,浓HCl100ml，安上回流装置(使用磨口接头，若用软木塞或橡皮塞时，就必须用锡铂纸包起来)，使其慢慢沸腾10H。冷却后加入硫酸锂(Li2SO4H2O)150g，水50ml,溴水23滴，不用回流装置开口煮沸15min,以释放出过量的溴。待冷却后稀释至1000ml，并过滤入棕色瓶中，密闭于冰箱中保存(冷却后溶液呈黄色，倘若仍呈绿色，须再滴加数滴液体溴，继续煮沸15min)。使用时用标准NaOH溶液滴定，以酚酞作为指示剂，滴定终点由蓝变灰，滴定后算出
7、酸的浓度。使用时大约加水1倍，使最终浓度相当于1Mol/LH+酸，此为Folin-酚试剂乙液(Folin试剂)。在测定时要注意，因为酚试剂仅在酸性条件下稳定，但此实验的反应只在PH值为10的情况下发生，所以当加酚试剂时，必须立即混匀，以便在磷钼酸磷钨酸试剂被破坏前即能发生还原反应，否则会使显色程度减弱。(2) 标准蛋白质溶液的配制称取25mg牛血清白蛋白，溶于100ml蒸馏水中，使最终浓度为250口g/ml。2. 标准曲线的绘制取7支试管，编号后，分别加入0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml标准蛋白质溶液，用蒸馏水补足1ml，使每管含蛋白量分别为0口g
8、、25口g、50口g、100口g、150口g、200口g、250g(必要时可做重复)。(1) 在每支试管中用定量加样器加入5Ml甲液，混匀，于30C下放置10Min。(2) 在每支试管中喷射加入0.5ml乙液，立即振荡混匀，在30C下保温30Min。(3) 准确到30min后，以不加标准蛋白试管中的溶液为空白，在500nM下用1cm光径的比色杯对系列标准蛋白溶液进行比色，测定光密度值。以蛋白浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。3. 样品的测定(1) 样品的提取：称取鲜样05g，用5ml蒸馏水或缓冲液研磨提取。取1.0Ml(视蛋白质含量适当稀释)样液加入试管中，然后重复步骤2的(2)、(3) 、(4)，以标准曲线中的0管为空白，测定吸光值。(2) 根据吸光值查标准曲线，求出比色液中的蛋白质含量。结果计算样品中蛋白的含量(mg/g)=CXVTV1XFWX1000(2-1)式中C：查标准曲线值(口g);VT：提取液总体积(ml)；FW：样品鲜重(g)；V1：测定时加样量（ml）。I-、:I*五、注意还原物质，其他酚类物质及柠檬酸对此反应有干扰。
