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1、全长cDNA在功能基因组学中的意义cDNA (complementary DNA)是指从mRNA反转录而得到的DNA,是mRNA的一个可靠的拷贝。 由于cDNA已经经过了剪接，而且含有完整的CDS,因此cDNA是研究基因功能以及基因结构的重 要资源。采用一般的方法构建的cDNA文库，其全长的比例往往比较低，主要是因为在cDNA第一 链的生成过程中，反转录酶在还没有生成完整的第一链的情况下就脱离了反应，以致得到不完整的 cDNA。CDNA第一链的生成一般使用polyT作引物，因此，一般cDNA文库中，含有大量的3端 EST,而mRNA5端的信息较少。但在功能基因组的研究中，5端序列更有意义。因此
2、，构建富 含全长的 cDNA 克隆的文库显得更加重要。1富含全长cDNA的文库的构建全长cDNA就是含有完整的3和5端的cDNA, mRNA的3端具有polyA作为“标签序列”(sequence tag)用于辩别mRNA或cDNA是否含有完整的3端。在生成第一链cDNA的过程中一般采用polyT 作引物，所以，得到的cDNA克隆一般都含有完整的3端。mRNA的5端与3端不同，它没有 高度保守的序列可用作“标签序列”来通过DNA/DNA或DNA/RNA杂交进行5端鉴定，只有帽 子结构(CAP)。因此为了分离到全长cDNA克隆，研究者一般利用“帽子结构”在mRNA的5 端加上一段序列或者其他标记物
3、。111常规方法这里说的常规方法，也就是够建一般的cDNA文库所采用的方法。分离出mRNA后，以mRNA为 模板、带接头的polyT作引物合成第一链cDNA，再以用第一链作模板合成双链cDNA，加上5端 接头，便可连到载体上。112 OligoCAP的方法OligoCAP的方法是在mRNA的5端加上一段寡核昔酸取代5 CAP。具体过程如图1所示。其 原理是在 BAP (bacterial alkaline phosphatase)和 TAP (tobacco acid pyrophosphatase)的作用下，完 整的mRNA (含CAP)的5端的G被切除，剩下一个一个磷酸基团，可以在RNA连
4、接酶的作用 下与Oligo adapter连接；而不含CAP的mRNA的5端则是一个羟基，无法与Oligo adapter连接。 这样，mRNA的5端也有了可识别的“标签序列”。113 CAPSelect的方法如图2所示，在生成cDNA第一链时，引物中带锚定序列，同时加入MnCl2。在MnCl2存在时，反 转录酶会在有CAP的mRNA为模板的第一链cDNA的3端加上三至四个dCMP,然后在末端转 移酶的作用下加上三到四个dAMP，在3端形成一粘端。这样，在RNA连接酶的作用下加上3 接头。这样，在5和3端都有特异的序列用于PCR扩增及全长cDNA的筛选。1 14 CAPTraper selec
5、t 的方法II. uDNA 官PmizTlnii 苦-nJKKis-H2翼bh畐dftR7r -m-riis型 H-FEIWirlYn芒=pwiw甲乂丁?|1 二扌WH Firrel kMadrIHPCnEr=-ynJl-JDtlEa7h-JU1聶KJi3,MTM.uclJg-crs-ixTFP-.D- : Lftsah 9 COMS rt itrHRmTSETKCTGDH-XLrhlfKTT 左PMyLtn弄 xhr - SI-Il L-Enur 厂 hnuizcDNA函 1 OligoCappingBMHeDNAMAllhiUiu IrgftieliPCS. AmwlinFNi.oll.G
6、f30咱 匸 1LAA IL计准 s?.g.l Syls-e5;昇 J3-_l一 ；*rr严 T -1 -1 -1TAP fujzEtc 邑NA libraryno-T(A)01 igo-dTm-K-hnrrimvr要过程如图3所示。它采用的策略就是cDNA第一链生成，DNA/RNA复合物未分离时，用生物素 标记RNA的5端，再用Rnase I处理。如果形成的第一链cDNA不完整，那在Rnase I的作用下， 突出的单链RNA被降解，5端的生物素标记也随之失去。生物素与磁珠偶联的亲和素吸附，这样, 经过层析，便可把全长与非全长的 cDNA 分离开。12文库中全长cDNA的识别以上介绍的几种方法可得到含有一定比例全长cDNA的文库。但并非所有的克隆都是全长cDNA克 隆，因此还必须从文库中筛选出全长cDNA克隆。121 序列测定为了节约成本和时间，并不一开始便测出文库中的所有序列。通用的做法是，首先测定CDNA3或 5端的序列。3序列可知道是否含有polyA,而5序列则可以用来推测全长的可能性。
