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1、白介素-18促动脉粥样硬化斑块内细胞凋亡的作用来源：创新医学网作者：李巧汶，李志梁，邱健1作者单位：1广州市广州军区总医院心内科(南方医科大学珠江医院心内科，广东广州510282)【摘要】目的探索白介素-18(IL-18)促进动脉粥样硬化斑块内细胞凋亡的作用及其机制。方法采 用30只老年同龄雄性动脉粥样硬化模型新西兰大白兔制成60个动脉粥样硬化板块标本，采用析因设计， 给予IL-18进行刺激，以不同的IL-18刺激时间和刺激浓度组合作为新处理组，将60个动脉粥样硬化斑 块标本随机分入新处理组中(n=5)，测量在不同刺激时间和刺激浓度下，纤维帽的厚度与脂核横截面厚 度的变化，TUNEL法检测斑块
2、内细胞凋亡的改变。结果 帽/核比值与斑块内细胞凋亡指数随着IL-18 的浓度及刺激天数的改变而变化(P0.01)。帽/核比值随着IL-18的浓度及刺激天数增加而降低(P0.01)， 斑块内细胞凋亡指数随着IL-18的浓度及刺激天数增加而升高(P0.01);斑块内细胞的凋亡指数与帽/核比 值呈显着线性负相关(r=-0.776, P0.001)。结论IL-18诱导斑块内细胞凋亡可能是其促易损斑块形成的 重要机制。【关键词】IL-18;动脉粥样硬化;细胞凋亡;易损斑块Abstract Objective To explore the role and mechanism of interleukin
3、-18 (IL-18) in promoting apoptosis of cells in atherosclerotic plaques.Methods 30 male New Zealand white rabbits were selected and euthanized.The entire length of the aorta was exposed and divided into several segments.Histological assessment of experimental atherosclerosis was evaluated.Rabbits in
4、experimental group were received stimulation of IL-18.New group was established according to work time and concentration of IL-18， the 60 specimens were randomly divided into the new treatment group (n= 5)，the thickness of fibrous cap and nuclear cross section were measured after stimulation of IL-1
5、8.At last，apoptosis was detected by TUNEL.Results The cap/core ratio and apoptotic index of plaques were changed according to the concentration and work time of IL-18I(P0.01)，with the concentration and work time of IL-18 increased，the cap/core ratio of plaques reduced (P0.01) and apoptotic index of
6、plaques raised inversely (P0.01)， apoptotic index of cell in plaques was significantly negatively correlated with the cap/core ratio(r=-0.776， P0.001).Conclusions IL-18 inducing apoptosis in plaque may be the main mechanisms of promoting the formation of vulnerable plaque.【Key words 】Interleukin-18;
7、Atherosclerosis;Apoptosis;Vulnerable plaque目前认为，易损斑块(VP)溃疡、破裂、血栓形成是急性冠脉综合征(ACS)发生的主要病理生理过程。 炎症是VP形成的最重要的机制之一，白介素-18(IL-18)作为在炎症反应系统中发挥中心性作用的炎症因 子，不但与动脉粥样硬化(AS)斑块的发生、发展1，2，且参可能与VP的形成1，3)，但IL-18 促VP形成的机制尚不清楚。研究表明4, 5)，IL-18可诱导多种细胞发生凋亡，而斑块内细胞凋亡 是VP的重要特征之一。由此推测IL-18可能通过诱导斑块内细胞凋亡促进VP的形成，但相关的证据 缺乏。本研究通过IL
8、-18刺激离体AS斑块，观察斑块内的细胞凋亡指数及形态特征，旨在探索IL-18 促进VP形成的可能机制。1材料与方法1.1动脉粥样硬化模型的制备30只老年健康雄性新西兰白兔，均为3月龄，平均体重2.2 kg,由广东省医学实验动物中心提供， 许可证号0055273。新西兰白兔予适应性喂养1 w后给予高脂饲料(内含1.5 %的胆固醇、5%猪油和0.5% 的胆盐)10 w，食物和水根据动物的需求供给。10 w后，注射过量的戊巴比妥处死动物。解剖动物暴露 动物的腹主动脉，清除附着于动脉上的脂肪与组织，根据斑块的分布把腹主动脉切割成60个血管块，上 述操作严格遵守无菌操作的原则。1.2离体标本分组及处理
9、采用析因设计，给予2种处理因素(4种刺激时间和3种刺激浓度)，以刺激时间和刺激浓度的不同 组合作为新处理组，将60个动脉粥样硬化斑块标本随机分入新处理组中(n=5)。把标本孵育在含血清的 Ham,s F10培养基，实验组除培养基外分别加入250、50四g/L两种浓度的兔IL-18分别刺激0、1 d、4 d、 7 d;对照组孵育在含血清的Ham，s F10培养基0、1 d、4 d、7 d。所有标本待培养基颜色变为橙黄色时更 换培养基，上述操作严格遵守无菌操作的原则。1.3标本大体染色及组织学特点的测量经上述处理后，甲醛固定标本，常规石蜡包埋、切片，组织HE染色。使用Image-Pro Plus图
10、像分析软 件采集分析图像，每个斑块至少取10处测量纤维帽厚度取平均值，测量处包括最厚与最薄处，测量每个斑 块纤维帽厚度与脂核横截面厚度的比值。1.4斑块细胞凋亡检测采用原位凋亡试剂盒TUNEL法检测。每张切片随机观察5个高倍视野(x400)，共计数300个细胞, 计算TUNEL染色阳性的细胞所占百分比(凋亡指数)。1.5统计学方法采用SPSS16.0统计软件进行统计分析，用xs表示，析因方差分析多因素各组数据间均数的差异， 线性相关分析法分析两个变量间的相关性。2结果2.1不同IL-18刺激时间和浓度斑块内细胞凋亡指数的变化AS斑块内的细胞凋亡指数随IL-18刺激的时间和浓度的改变而变化(P0
11、.01)。随着IL-18刺激时间 的延长、刺激浓度的升高，斑块内的细胞凋亡指数有上升趋势(P0.01)。见表1，图1。2.2不同IL-18刺激时间和浓度斑块帽/核比值的变化AS斑块的帽/核比值随IL-18刺激的时间和浓度的改变而变化(P0.01)。随着IL-18刺激时间的延长、 刺激浓度的升高，斑块的帽/核比值有下降趋势(P0.01)。见表2。2.3 斑块细胞的凋亡指数与帽/核比值的相关性分析对斑块细胞的凋亡指数与帽/核比值进行线性相关性分析，结果显示，斑块细胞的凋亡指数与帽/核 比值呈显着线性负相关（r=-0.776, P0.001）。表1不同IL-18刺激时间和浓度斑块内细胞凋亡指数的变
12、化表2不同IL-18刺激时间和浓度时斑块帽/核比值的变化图1不同斑块中的凋亡细胞（箭头所示，x400）3讨论ACS是以冠状AS斑块侵蚀或破裂继发的完全或不完全闭塞性血栓形成为病理基础的一组临床综合 征，包括不稳定型心绞痛、ST段抬高型心肌梗死、非ST段抬高型心肌梗死。一般认为，引起ACS发生 的主要病理生理过程为VP的溃疡、破裂、血栓的形成。炎症反应与VP的形成密切相关，炎症可通过 斑块内的炎症细胞及其分泌的促炎症因子使斑块的纤维帽变薄、脂核变大，导致VP表型的形成。IL-18 是一种新近发现的在炎症反应中发挥重要作用的促炎症介质，研究表明13），IL-18参与了 AS斑 块的形成、进展乃至V
13、P形成的整个过程。临床资料也6）显示，ACS患者血浆IL-18的水平显着升 高，提示IL-18与VP的发生发展密切相关。然而，IL-18促VP发生发展的机制目前尚不清楚，本研究 通过IL-18对离体AS斑块的刺激，观察IL-18对AS斑块内细胞凋亡指数以及AS斑块形态特征的影响， 以探索IL-18促VP发生发展的可能机制。本研究结果显示，AS斑块内的细胞凋亡指数随IL-18刺激的时间和浓度的改变而变化，随着IL-18 刺激时间的延长、刺激浓度的升高，斑块内的细胞凋亡指数有上升趋势。AS斑块内细胞凋亡增加可增 大斑块内的坏死中心，促使纤维帽变薄，导致VP表型的形成，因此，斑块内细胞凋亡是VP的主
14、要特 征之一。本研究结果提示，IL-18可能通过诱导斑块内的细胞凋亡促进VP的形成。IL-18诱导斑块内细 胞凋亡的可能途径包括：IL-18能通过刺激机体释放多种促炎症介质（TNF、IL-1伏IL-6、iNOS）诱导 细胞凋亡5。IL-18本身可直接激活外源性凋亡通路和内源性线粒体凋亡通路，诱导细胞凋亡。IL-18 一方面可通过诱导TNF的产生、上调NK细胞和Th1细胞的Fas-L表达、增强的Fas-L型介导的细胞毒 活性激活外源性凋亡通路7, 8），另一方面，IL-18还可促进线粒体释放细胞色素C从线粒体进入细 胞质而激活内源性线粒体凋亡通路9。从AS斑块标本的形态特征进行分析，结果表明，A
15、S斑块的帽/核比值随IL-18刺激的时间和浓度 的改变而变化，随着IL-18刺激时间的延长、刺激浓度的升高，斑块的帽核比值有下降趋势，引起斑块 趋于VP的形态特征。另外，斑块内细胞的凋亡指数与帽/核比值的线性相关性分析显示，斑块内细胞的 凋亡指数与帽/核比值呈显着线性负相关，提示斑块内的凋亡细胞增加促进VP形态特征的形成。斑块内 的细胞凋亡增加导致VP形成的可能机制包括：细胞凋亡后，一方面可释放胆固醇，使AS斑块核心 形成、扩大，损伤纤维帽，另一方面，释放蛋白酶和少量炎性因子，刺激巨噬细胞分泌基质降解蛋白酶， 损伤纤维帽，致纤维帽变薄10，加速VP的形成;凋亡细胞（巨噬细胞）被吞噬清除过程中，
16、可诱发 炎症反应，促进AS斑块不稳定11。巨噬细胞凋亡后，其数目减少，致使凋亡的平滑肌细胞、巨 噬细胞等不能被有效吞噬，促进AS斑块内脂质核心形成和扩大，使纤维帽易于破裂;细胞凋亡后可释 放促血栓形成物质（如组织因子等）12，促进血栓的形成。可见，随着随着IL-18刺激时间的延长、刺激浓度的升高，斑块内的细胞凋亡指数有上升趋势，相 反，斑块的帽/核比值有下降趋势，而斑块内的细胞凋亡指数和斑块的帽/核比值也呈显着负相关，这就 提示了 IL-18通过诱导斑块内的细胞凋亡可能是促进VP形成的重要机制。在临床中，检测血浆IL-18 的浓度对VP诊断有一定的临床意义，目前，已有不少学者13, 14提出通过检测AS斑块内细胞凋 亡以诊断VP;在VP的防治中，抑制IL-18的生物学效应及细胞凋亡将可能成为预防VP形成的重要手 段。1 Mallat Z, Corbaz A, Scoazec
