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1、题 目新型多巴胺封端聚合物的合成及其对活细胞的包被作用研究目录摘要1Abstract2第1章前言3第1.1节活细胞包被概述3第1.2节 多巴胺结构及其对细胞的包被3第1.3节 课题的提出4第2章 实验部分5第2.1节 试剂与仪器5第2.2节 多巴胺基团封端聚合物的合成6第2.2.1节 多巴胺基团封端的聚（乙二醇）甲基丙烯酸酯（DA-pOEGMA）的合成6第2.2.2节 多巴胺基团封端的乙二醇甲基丙烯酸酯（OEGMA）与甲基丙烯酰胺生物素单体共聚物（DA-p(OEGMA-co-Biotin)）的合成7第2.3节 细胞操作实验8第2.3.1节 HeLa细胞（宫颈癌细胞）培养8第2.3.1.1节 H
2、eLa细胞复苏8第2.3.1.2节 HeLa细胞换液8第2.3.1.3节 HeLa细胞传代8第2.3.2节 细胞计数和种植9第2.3.3节 多巴胺基团封端的聚合物包被HeLa细胞实验9第2.3.3.1节 扫描电子显微镜（SEM）方法检测聚合物DA-pOEGMA包被HeLa细胞实验10第2.3.3.2节 共聚焦荧光显微镜方法检测聚合物DA-p(OEGMA-co-Biotin)包被HeLa细胞实验10第2.4节 细胞毒性实验11第2.4.1节 L929细胞（小鼠成纤维瘤细胞）培养11第2.4.2节 Cell Counting Kit-8（CCK8）检测细胞毒性与增殖实验11第3章 结果和讨论13第
3、3.1节 多巴胺基团封端的聚合物分子核磁图13第3.2节 多巴胺基团封端的聚合物分子GPC图14第3.3节 多巴胺基团封端的聚合物包被HeLa细胞实验结果15第3.3.1节 扫描电子显微镜（SEM）检测聚合物DA-pOEGMA包被HeLa细胞实验结果15第3.3.2节 共聚焦荧光显微镜检测聚合物DA-p(OEGMA-co-Biotin)包被HeLa细胞实验结果16第3.4节 多巴胺基团封端的聚合物包被细胞的毒性实验结果17结论19参考文献20致谢22摘要在细胞表面进行包被可以保护细胞免于外来物质的侵略，提高细胞稳定性。本文利用多巴胺在不同表面粘附的普适性，首先通过化学合成的手段制备多巴胺基团修
4、饰的光引发剂，随后利用上述合成的光引发剂进行乙二醇甲基丙烯酸酯（OEGMA）单体的光聚合反应，得到新型的多巴胺封端的聚合物。对制备的聚合物进行结构和分子量分析，进一步验证聚合物对哺乳动物细胞系HeLa细胞进行包被的可行性。扫描电子显微镜（SEM）和激光共聚焦显微镜图片都验证了多巴胺封端的聚合物对HeLa细胞的成功包被。并且，细胞毒性实验结果也证实了这种聚合物具有很好的生物相容性，不会影响细胞的粘附和增殖。本工作中的策略为实现哺乳动物细胞的包被提供了一项可行性的方案。另外，利用光聚合反应高效的优点，该方法为后期改变聚合单体的种类制备一系列多巴胺封端的具有不同结构和功能的聚合物来研究外源引入到细胞
5、表面的成分对细胞行为的影响奠定了基础。关键词：细胞膜表面包被 多巴胺 光引发聚合AbstractCell surface coatings are capable of protecting cells against the invasion of foreign substances and enhancing the stability of cells. In this work, the universality of dopamine in the different surface adhesion is utilized to coat cell surfaces. First
6、, the photo-initiator containing dopamine groups was chemically synthesized and then poly (ethylene glycol) methacrylate (OEGMA) with dopamine end groups was prepared via light polymerization. The structures and molecular weights of the obtained polymers were characterized and the feasibility of the
7、 polymers with dopamine end groups for coating the mammalian cell line HeLa was demonstrated. Scanning electron microscope (SEM) and laser confocal microscope images proved that HeLa cells were coated successfully by the synthetic polymers with dopamine end groups. Furthermore, the cytotoxicity assa
8、y showed that the cell adhesion and proliferation would not be influenced by the addition of synthetic polymers into medium with different concentrations, indicating that polymers with dopamine end groups have good biocompatibility. In this work, the functionalization of polymers with dopamine group
9、s provided an alternative strategy for coating the mammalian cell surfaces. And the high efficiency of light polymerization will benefit the preparation of a series of dopamine-functionalized polymers with different structures and molecular weights to study the influence of exogenous polymers coated
10、 on cell surfaces on the different cell behaviors. Keywords: cell surface coating dopamine light polymerization第1章 前言第1.1节 活细胞包被概述活细胞包被是基于单个活细胞的研究，对于大多数活细胞而言，细胞的耐受性较差，对它们的生存环境要求严格。这一特点使基于单个活细胞的应用受到了限制。在自然界中，某些生物体系，例如细菌、植物、藻类和真菌，已经进化成在恶劣的环境下通过坚硬的外壳保护自己的物种。利用这一特点，我们可以借助外壳结构给予细胞特定的保护，使之免受外部恶劣环境的破坏。将外壳这
11、一概念应用到单个活细胞上，就如同在细胞表面增加了一个保护层，即细胞包被。经研究人员研究发现包被的细胞仍能保持其生理活性并能通过包被的厚度有效地控制细胞分裂周期1。因此，活细胞包被是一项在细胞层面上对细胞进行研究的技术和理念，利用这一技术可以探究基于细胞的应用和细胞的生理过程。在这种技术的支撑和细胞生理学的了解下，我们可以进行一些实际应用，可用于增加基于细胞设备的稳定性，包括传感器、生物反应器、微流体设备以及细胞生物的基础研究，例如微生物孢子已被用于分析物检测2和细胞模式3-4。第1.2节 多巴胺结构及其对细胞的包被能应用到细胞表面包被的物质需要具有良好的生物相容性，受海洋贻贝类生物粘附机理的启
12、发，研究者发现多巴是贻贝类生物粘性蛋白的重要组成成分。多巴胺是多巴衍生物的组成成分之一，具有氨基和邻苯二酚基两个功能性基团，并且多巴胺中邻苯二酚基具有很强的配位能力，可以实现对表面的黏附5-8。研究表明多巴胺具有的配位能力和强共价键性，是贻贝黏附蛋白具有超强黏附力的重要原因9。在碱性有氧条件下，多巴胺发生氧化自聚后形成聚多巴胺10。多巴胺具有很多优点，例如生物相容性、良好的粘附性、亲水性以及可后续功能化等，所以多巴胺成为细胞包被的首选物质之一11。yang等人首次研究了将聚多巴胺包被在酵母细胞表面形成保护性的壳层1。对酵母细胞进行聚多巴胺包被后，酵母细胞保持有细胞活性。研究人员发现聚多巴胺包被
13、的细胞可以用于制备全细胞生物催化剂，这种催化剂具有快速动理学、高稳定性和可重用性等优点12。另外，研究发现聚多巴胺还具有类似黑色素吸收紫外线的功能。可将此性质应用到重组或生物工程微生物这样的脆弱生物体以使它们获得光致旋转的能力13。此外利用多巴胺的可后续功能化性质，可对包被的细胞进行二次修饰，分别获取多种不同功能化的细胞，还可将多巴胺包被的细胞粘附在各种基材表面5，这一操作使得包被的活细胞可广泛应用到细胞传感器、生物马达、生物催化、细胞疗法及细胞芯片等领域 14-16。目前，一些研究人员通过在多巴胺包被的细胞表面接枝细胞相容性及生物活性的聚合物来扩展细胞包被的应用，主要借助于合成的多巴胺引发剂
14、通过表面引发原子转移自由基聚合方法（“grafting from”）来实现表面接枝细胞相容性聚合物。但是表面引发原子转移自由基聚合条件应用到细胞表面时具有很多的弊端，其中包括聚合体系中含有过渡金属催化剂（比如Cu）、有机溶剂以及在聚合过程中的脱氧环境17，这些聚合条件都不利于细胞的生存。另外，细胞膜表面原位聚合到细胞表面的聚合物不易表征，这一缺点限制了不同结构聚合物对细胞包被及细胞行为影响的研究。并且目前利用多巴胺聚合物对细胞包被的研究，主要用的是具有较高机械强度细胞壁的菌类1,5,12-13，而具有广泛生物功能的哺乳动物细胞研究甚少。而哺乳动物细胞的细胞膜层很薄，与菌类相比具有较差的环境耐受
15、性，因此要实现对其表面的包被，就需要发展一种具有优异细胞相容性且更加灵活简便的细胞包被方案。第1.3节 课题的提出针对以上需求，本文利用化学合成的手段合成了多巴胺基团修饰的光引发剂，并首次尝试利用该光引发剂引发聚合制备多巴胺基团封端的特定结构聚合物，并以“grafting to”的方法粘附到细胞表面。这样一种先将聚合物制备好而后粘附到细胞表面的方法避免了金属催化剂以及有机溶剂对细胞活性的影响，具有很好的细胞相容性，并且具有聚合高效及聚合物易表征等优势18。本工作所建立的实验方法能够很好地维持哺乳动物的细胞活性，为实现不同类型的生物活性聚合物包被细胞提供了一项安全又高效的方案。第2章 实验部分第2.1节 试剂与仪器实验用到的试剂及仪器见表2-1和表2-2。 第2.2节 多巴胺基团封端聚合物的合成第2.2.1节 多巴胺基团封端的聚（乙二醇）甲基丙烯酸酯（DA-pOEGMA）的合成在一个干净的10 mL圆底烧瓶中加入0.3613 g （1 mmol）乙二醇甲基丙烯酸酯（OEGMA）、4.2 mg （0.01 mmol）多巴胺引发剂以及3 mL DMF，搅拌。通氮气30 min，在365 nm UV光照条件下反应15 min后结束反应。将产物透
