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1、放线菌抗生素的发酵及目的产物的提取一、实验目的1、熟悉掌握土壤中分离抗生素及培养方法2、了解和掌握种子制备和摇瓶发酵技术和方法3、了解抗生素发酵的一般规律和代谢调控理论4、了解小型发酵罐的基本结构5、熟悉掌握小型发酵罐的使用方法和保养6、掌握抗生素生物效价测定的原理和方法；7、掌握管碟法测定抗生素生物效价相关的操作方法。8、掌握放线菌次级代谢物的初步纯化及牛津杯实验的基 本原理和操作技术二、实验原理 发酵罐是进行液体发酵的特殊设备。生产上使用的发酵罐容积 大，均用钢板或不锈钢板制成；供实验室使用的小型发酵罐，其容积 可从约1L至数百升或稍大些。一般来说，5L以下是用耐压玻璃制作 罐体，5L以上
2、用不锈钢板或钢板制作罐体。发酵罐配备有控制器和 各种电极，可以自动地调控试验所需要的培养条件，是微生物学、遗 传工程、医药工业等科学研究所必需的设备。 抗生素(anti bio tics )是由微生物(包括细菌、真菌、放线 菌属)或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性 的一类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。现 临床常用的抗生素有转基因工程菌 培养液液中提取物以及用化学 方法合成或半合成的化合物 放线菌发酵结束后，次级代谢物可能与菌体结合，工业上常采 用草酸或磷酸等酸化剂处理，释放与菌体结合的次级代谢物，并采用 加热发酵液70 C，2 min使蛋白凝固，所得酸
3、性滤液，在经碱处理， 进一步去除蛋白。抗生素的效价常采用微生物学方法测定，它是利用抗生素对特定 的微生物具有抗菌活性的原理来测定抗生素效价的方法，如管碟法。 管碟法是目前抗生素效价测定的国际通用方法，我国药典也采用此 法。管碟法是根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩散渗透作用，比较 标准品和检品两者对试验菌的抑菌圈大小来测定供试品的效价。管碟 法的基本原理是在含有高度敏感性试验菌的琼脂平板上放置小钢管 （内径 6.0土0.1 mm，外径 8.0土0.1 mm，高 10土0. lmm），管内放 人标准品和检品的溶液，经1618小时恒温培养，当抗生素在菌层培 养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自
4、然梯度，即扩散中心 浓度高而边缘浓度低。因此，当抗生素浓度达到或高于MIC （最低抑 制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的无菌生长 的区域，常呈圆形，称为抑菌圈。根据扩散定律的推导，抗生素总量 的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系，比较抗生素标准品与检品 的抑菌圈大小，可计算出抗生素的效价。常用的管碟法有：一剂量法、二剂量法、三剂量法。后二法已经 列入药典。二剂量法系将抗生素标准品和供试品各稀释成一定浓度比 例（2:1或4:1）的两种溶液，在同一平板上比较其抗药活性，再根 据抗生素浓度对数和抑菌圈直径成直线关系的原理来计算供试品效 价。取含菌层的双层平板培养基，每个平板表面放置
5、4个小钢管，管 内分别放入供试品高、低剂量和标准品高、低剂量溶液。先测量出四 点的抑菌圈直径，按下列公式计算出检品的效价。（1） 求出 W 和 V： W= （SH+UH） - （SL+UL）（式 2.10-1）V= （UH+UL） -（SH+SL）（式 2.10-2）式中：UH：供试品高剂量之抑菌圈直径；UL：供试品低剂量之抑菌圈直径；SH：标准品高剂量之抑菌圈直径；SL：标准品低剂量之抑菌圈直径；（2） 求出B : 0 二D antilog （IV/W）（式 2.10-3）式中：0 :供试品和标准品的效价比；D：标准品咼剂量与供试品咼剂量之比，一般为1 I：高低剂量之比的对数，即log2或l
6、og4。 求 出 Pr :Pr = Ar X 0（式 2.10-4）式中：Pr:供试品实际单位数；Ar :供试品标示量或估计单位 甲醛滴定法测定氨基氮含量：水溶液中的氨基酸为两性离子， 因而不能直接用碱滴定氨基酸的羧基。用甲醛处理氨基酸，甲醛与氨 基结合，可形成羟甲基衍生物，使NH3+上的H+游离出来，这样就可 用碱滴定NH3+放出的H+，从而计算出氨基氮含量。如样品中只含 有某一种已知氨基酸，由甲醛滴定的结果即可算出氨基氮的含量。如 果样品是多种氨基酸的混合物（如蛋白质水解物），则滴定结果不能 作为氨基酸的定量依据。甲醛滴定法常用于测定蛋白质的水解程度, 随着水解程度的增加，滴定值增加，当水
7、解完全后，滴定值保持恒定。甲基红的变色范围是PH4.46.2,意思是说：1. 其pH值在4.46.2区间时，呈橙色，2. 其pH值W4.4时，呈红色,因是靠近酸性强的一边时的颜色, 故又称之为酸色。3. 其pH值三6.2时，呈黄色,因是靠近碱性强的一边时的颜色, 故又称之为碱色二、仪器与材料（一）培养基高氏一号培养基：可溶性淀粉 20.0g NaCl 0.5g KN03 1.0gK2HPO4 05g MgSOf70 0.5g FeSOf70 O.Olg 蒸馏水 1000ml，PH 7.4， 淀粉3%,葡萄糖2%,黄豆饼粉2.5%,蛋白胨0.5% ,酵母粉 0.5%, MgSO40.1%,(NH
8、4)2SO4 0.3%, KH2PO4 0.03%,CaCO 0.4%, PH 6.0。 黄豆饼粉4g,淀粉10g,酵母粉0.25 g ,蛋白胨1.5g,MgSO4 0.025 g, CaCO3 0.4g, (NH4)2SO4 0.3 g,a-淀粉酶(105u/ml)0.01ml.100ml PH7.4-7.6可溶性淀粉 2.0g, NaCl 0.05g, KNO3 0.1g, K2HPO4 0.05g,MgSO4.7H2O 0.05g, FeSO4.7H2O 0.001g,加蒸馏水至100ml, PH 7.4,牛肉膏蛋白胨牛肉膏(5.0g),蛋白胨(10.0g), NaCl (5g),蒸馏水
9、(1000mL), pH 7.27.4发酵罐培养基（2L）：黄豆饼粉80g淀粉200g酵母粉5 g蛋白胨30gMgSO40.5 gCaCO38g(NH4) SO246 gCH定粉酶(105u/ml)0.2ml（二）流加补料碳源：葡萄糖（10%） 300ml,控制 1%； 2000*l%=20g,200ml氮源：硫酸铵（10%） 250ml,控制16%调 PH 值：0.1MHC1 0.1MNaOH（三）分析指标及方法所用试剂及溶液测残糖-DNS法1.3，5二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）：将6.3g的3，5二硝基水杨酸和2molNaOH溶液加到500ml含有182g酒石酸钾钠的热 水溶液中，再加5
10、g结晶苯酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸 馏水定容到1000ml2. 1.0mg/ml葡萄糖溶液：称取1g葡萄糖，加蒸馏水定容到 1L。3. 6mol/l氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠24g，加蒸馏水定容到 100ml。4. 6mol/l的盐酸：取浓盐酸49.68ml,加蒸馏水定容到100ml。 测残氮的方法-甲醛法1. 甲基红：0.1g甲基红，用95%乙醇定容100ml。2. 0.3mol/LHCL:取浓盐酸2.48ml,加蒸馏水定容到100ml。3. 0.02858mol/L NaOH:称 0.11432g,定容 100ml。4. 1%酚酞指示剂：称取1g酚酞指示剂粉末。溶于100ml
11、95% 乙醇溶液中。5. 95%乙醇：取乙醇96ml，倒入100ml容量瓶中定容值100ml。6. 18%中性甲醛：取48ml 38%的甲醛加入小于100ml容量瓶， 往溶液中加两滴酚酞用氢氧化钠滴定刚好变红，定容到100ml。（四）器材玻璃试管、试管架、吸管（1ml，2ml，10ml）、吸耳球、离心管、 容量瓶、烧杯、三角瓶（250 ml，500ml）、量筒（250ml，500ml， 1000ml）、玻璃棒、试纸、塑料漏斗、电炉、接种铲（针）振荡培养 箱、恒温箱、台秤、5L-发酵罐，无菌室、培养皿（直径9 cm）、陶 瓦盖、钢管、钢管放置器、恒温培养室、灭菌刻度吸管、玻璃容器、 称量管、毛细
12、滴管、天平、直尺或游标卡尺、超净工作台，无菌培养 皿，酒精灯，牛津杯，镊子，移液器等等（五）生物效价测定所需材料（1）菌种：大肠杆菌（Escherichiacoli），菌液浓度约为106个/mL。 菌株保存的时间过久，影响其对抗生素的敏感度，导致抑菌圈变大、 模糊或者出现双圈。如若菌株不纯，也会造成这样的结果。因此，菌 液在使用一段时间后，可以重新配制纯化或者减小原来菌液在使用中 的稀释倍数。（2）抗生素标准品和供试品：头抱拉定标准品和供试品。（3）培养基：效价检定用培养基1号。（4）无菌缓冲液：称取磷酸氢二钾5.59g，磷酸二氢钾0.41g，加水 1000mL，即为pH 7.8的磷酸盐缓冲液
13、。制备缓冲液的试剂应为分析 纯，配制后的缓冲液应澄清，分装于玻璃容器内，经121C蒸气灭菌 30 min备用。（5）草酸，10 M NaOH四、实验步骤筛选高产放线菌从土壤里筛选出高产放线菌，于斜面培养基中保藏接种在超净工作台上，将长好的斜面抱子用无菌接种针挖块约0.5x1cm2，接种于灭过菌的高氏一号培养基中。培养将接种好的种子摇瓶于28C恒温室摇床上，转速为200r/min, 培养48小时左右。实罐灭菌1、将冷凝水管路断开，拔下电极，打开罐盖，将发酵培养基装 入发酵罐及补料瓶，易产生泡沫的培养基尽量不要超过两升。2、连接管路：取样管路连接，补料管路连接；空气过滤器用硅 胶管与罐盖空气管连接
14、，并用弹簧夹夹紧；排气口与过滤器用硅胶管 连接；安装温度电极、pH电极、溶氧电极，pH电极用们帽盖紧电极 上端口，溶氧 电极用铝铂纸包裹电极上端口，防止受潮。盖紧其它 罐盖接口。3、提起玻璃罐体及补料瓶放入灭菌锅，盖好牛皮纸，盖好锅盖, 确定发酵温度及时间。4、灭菌结束后，尽快将罐放回原位并尽快通入空气。发酵操作1、将灭菌后的罐体放回原位，连接冷凝水管路，通入冷凝水， 连接通气管路，调整通气量至35L/min。2、将温度电极、pH电极、溶氧电极与控制器连接。3、补料管连接：打开补料蠕动泵防护盖，搬开进出口处的白色 管夹，将硅胶管嵌入入口处的管夹并夹紧，用手转动泵头，将硅胶管 沿凹槽安装直至出口
15、处，开手动开关约十秒后夹紧出口处管夹，关手 动开关；将酒精棉球放在罐盖补料口内，将针头插入并穿透密封盖； 打开蠕动泵手动开关，使输液管中充满料液，置于自动状态。接种将培养48小时的摇瓶种子接种于发酵罐中，使用接种圈放置酒精 棉点燃，进行无菌接种，接入100ml种子。接种后立即进行第一次取 样。发酵生产发酵过程的测定： 发酵液状态观察：粘度、颜色、气味、菌丝形态 发酵中残糖的测定-DNS法：1. 取1.0mg/ml葡萄糖标准溶液，按下表加入试剂。沸水浴加 热5min，冷水冷却定容至25ml摇匀，在520nm按波长测吸光度。编号葡萄糖标准溶液/ml水/ml溶液糖含量/mgDNS试剂/ml00201.510.21.80.21.520.41.60.41.530.61.40.61.540.81.20.81.551.01.01.01.561.20.81.21.571.40.61.41.581
