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1、紫外吸收法测蛋白质含量的方法蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质 具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白 质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用 一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质 含量的测定。紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度的 盐，例如生化制备中常用的（NH4）2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别 适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知 道其绝对值。此法的特点是测定蛋白质含量的
2、准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定 蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有 一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品 中含有嘌吟、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰 可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白 质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误 差。此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化， 因此要注意溶液的pH值，测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。 1.280nm的光吸收法因蛋白质分子中的酪氨酸、
3、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处具有最大吸收，且各种 蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光 度值是最常用的紫外吸收法。测定时，将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白质溶液的溶剂（水或 缓冲液）作空白对照，在紫外分光度计上直接读取280nm的吸光度值A280。蛋 白质浓度可控制在0.11.0mg/ml左右。通常用1cm光径的标准石英比色皿，盛有 浓度为1mg/ml的蛋白质溶液时，A280约为1.0左右。由此可立即计算出蛋白质 的大致浓度。许多蛋白质在一定浓度和一定波长下的光吸收值（A1%1cm ）有文献数据可查， 根据此光吸收值可以较准确地计算蛋白质浓度
4、。下式列出了蛋白质浓度与（A1%1cm）值（即蛋白质溶液浓度为1%，光径为1cm时的光吸收值）的关 系。文献值A1%1cm,A称为百分吸收系数或比吸收系数。蛋白质浓度=（A280J0 ）/ A1%1cm,280nm （mg/ml）（Q 1% 浓度 10mg/ml）2.280nm和260nm的吸收差法核酸对紫外光有很强的吸收，在280nm处的吸收比蛋白质强10倍（每克），但 核酸在260nm处的吸收更强，其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm处的消光 系数是280nm处的2倍，而蛋白质则相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸 收值。通常：纯蛋白质的光吸收比值：A280/A260 1.8
5、纯核酸的光吸收比值：A280/A260 0.5含有核酸的蛋白质溶液，可分别测定其A280和A260，由此吸收差值，用下面的 经验公式，即可算出蛋白质的浓度。蛋白质浓度=1.45xA2800.74xA260 （mg/ml） 此经验公式是通过一系列已知不同浓度比例的蛋白质（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混合液所测定的数据来建立的。3.215nm与225nm的吸收差法蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收测定时，可用215nm与 225nm吸收值之差，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。用已知浓度的标准蛋白质，配制成20100 mg/ml的一系列5.0ml的蛋白质溶 液，分别测
6、定215nm和225nm的吸光度值，并计算出吸收差：吸收差D= A215 -A225以吸收差D为纵座标，蛋白质浓度为横座标，绘出标准曲线。再测出未 知样品的吸收差，即可由标准曲线上查出未知样品的蛋白质浓度。本方法在蛋白质浓度20100mg/ml范围内，蛋白质浓度与吸光度成正比，NaCl、（NH4） 2SO4以及0.1M磷酸、硼酸和Tris等缓冲液，都无显著干扰作用，但是 0.1N NaOH,0.1M乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、巴比妥等缓冲液的215nm光吸收 值较大，必须将其浓度降到0.005M以下才无显著影响。4.肽键测定法蛋白质溶液在238nm处的光吸收的强弱，与肽键的多少成正比。因此可以用标准 蛋白质溶液配制一系列50500mg/ml已知浓度的5.0ml蛋白质溶液，测定238nm 的光吸收值A238，以A238为纵座标,蛋白质含量为横座标，绘制出标准曲线。 未知样品的浓度即可由标准曲线求得。进行蛋白质溶液的柱层析分离时，洗脱液也可以用238nm检测蛋白质的峰位。本方法比280nm吸收法灵敏。但多种有机物，如醇、酮、醛、醚、有机酸、酰胺 类和过氧化物等都有干扰作用。所以最好用无机盐，无机碱和水溶液进行测定。若含有有机溶剂，可先将样品蒸干，或用其他方法除去干扰物质，然后用水、稀 酸和稀碱溶解后再作测定。
