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1、酪氨酸酶活性抑制实验方案报告1. 1材料：酪氨酸酶(或用马铃薯制备)、L-酪氨酸、熊果苷、磷酸氢二钠、磷酸二氢 钠恒温仪、紫外分光光度计、离心机。1.2试剂配制1) 磷酸钠缓冲液(1/15 mol/L, pH=6. 8)精确称取1.000 g磷酸二氢钠，1.186 g磷酸氢二钠，加入少量去离子水溶 解后，定容至500 mL,4C冰箱保存备用。2) L-酪氨酸溶液(7.5 mmol/L)精确称取L_酪氨酸0.272 g,先加入数滴浓盐酸，加去离子水约50 mL，微 热完全溶解后，用氢氧化钠溶液调pH至7左右，加去离子水定容至200mL。3) 受试液精确称取受试样品0.1g，分别溶于20 mL去离
2、子水，得到5 mg/mL的待测 液，再对倍稀释到 2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL、0.3125 mg/mL。4) 阳性对照(+CK)精确称取0.1 g熊果苷粉末，溶于20mL的去离子水中，得到5 mg/mL的阳性 对照母液，再对倍稀释到 2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL、0.3125 mg/mL。5) 酪氨酸酶液的制备以新鲜完好的马铃薯制取酪氨酸酶液。具体操作为：将马铃薯洗净，于4C 预冷4h左右。去皮，切成约1.0 cm3 丁状，于-20C冷冻过夜。称重，按1： 1( W:V )的比例加A4C预冷的磷酸钠缓冲液，用组织捣碎机制
3、成匀浆，3层纱布 过滤，滤液于4000 r/min离心10 min，上清液即为所得的酪氨酸酶粗酶液，4C 保存，2 h内用完。1.3检测方法总反应体系为5mL。具体设计见表1。在此体系中，受试液，包括阳性对照熊果苷的终浓度(mg/mL)梯度为 0.03l25、0.062 5、0.125，0.25、0.5。实验时，向试管中依次加入磷酸盐缓冲液、不同浓度梯度的受试液(包括阳性 对照)、酶液，于30C水浴10 min。然后加入底物L-酪氨酸，立即开始计时。测 定反应20 min时475 nm波长下的吸光值。测定时，以相应的阴性对照为参比，用 下列公式计算受试液(包括阳性对照)对酪氨酸酶的抑制率，并依据浓度一酶抑制率 曲线估计半数抑制浓度(IC50)的近似值。抑制率二(A-B)/AXl00%其中，“A”为标准对照的吸光值，“B”为受试液(或阳性对照)的吸光 值。每个实验做3个平行。抑制率高表明其对酪氨酸酶活性的抑制强度高。表1 5mL试验体系设计注：用分光光度计测量吸光值时，“受试液”、“标准对照”、“阳性对 照”分别以“阴性对照1”、“阴性对照2”、“阴性对照3”调零。
