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1、基因工程一、基因工程的概念基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生 物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在 DNA分子水平上进行设计和施工的额，因此又叫做DNA重组技术。基因工程的别名基因拼接技术或DNA重组技术操作环境生物体外操作对象基因操作水平DNA分子水平基本过程剪切拼接导入表达实质原理基因重组结果改造的方向克服远缘杂交不亲和的障碍，定向改造生物的遗传特性二、基因工程的基本工具1、限制性核酸内切酶“分子手术刀”2、DNA连接酶-“分子缝合针”3、 基因进入受体细胞的载体 “分子运输车”1 “ 分子
2、手术刀 ” 限制性核酸内切酶 （限制酶）（1 ）存在：主要存在于原核生物中。（2 ）特性：特异性，一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。3 ）切割部位： 磷酸二酯键4 ） 作用： 能够识别双链DNA 分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸 二酯键断开。(5识别序列的特点:呈现礦基互补对轧无论是奇数个戚基还是偶数个碱基都可以找到一条中心軸练如图冲轴统两侧的双链DNAGC GC上的碱基是反向对称重財洌的如口 CG以中谀为中轴线CCAGG A臥两侧碱基互补对称；以为抽俩侧做基互补(6 )切割后末端的种类:DNA分子经限制酶切割产
3、生的DNA片段末端通常有两种形式黏性末端和平末端 。当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA 的两条链分别切开时,产生的是黏性末端,当限制酶在它识别序列的中轴线处 切开时，产生的则是平末端。EcoEl 1du A :XIZH：i于口寸产生的两科不I司木轴術头裘示附的切制役: 2. “分子缝合针” 一DNA连接酶1作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成DNA分子。工h w种类(2类型E col DNA连接酶T4DNA连接酶来源大肠杆菌T4噬菌体功能特性只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来缝合两种末端，但连接平末端之间的效率较低相同点：都连接磷酸二酯键G1 A A T T
4、CI-tt-l-i-i IC T T A3. “分子运输车”载体(1) 载体具备的条件： 能在受体细胞中复制并稳定保存。 具有一个至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。 具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。(2) 最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核之外，并具有自我复制 能力的双链环状DNA分子。(3) 其他载体：入噬菌体的衍牛物、动植物病毒。(4) 载体的作用： 作为运载工具，将目的基因送入受体细胞。 在受体细胞内对目的基因进行大量复制。【解题技巧】(1) 限制酶是一类酶，而不是一种酶。(2) 限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或
5、强碱均易使之变性 失活。(3) 在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。(4) 获取一个目的基因需限制酶剪切两次，共产生4个黏性末端或平末端。(5) 不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶 切割，产生的黏性末端一般不相同。(6) 限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便于进行检测。(7) 基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。(8) 基因工程中有3种工具，但工具酶只有2种。例1限制酶Mun I和限制酶E
6、coR I的识别序列及切割位点分别是一 C I AATTG 和一G ! AATTC。如图表示四种质粒和目的基因，其中，箭头所指部位为限制酶的识别位点，质粒的阴 影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是冃的基因CTTAAGCTTAAGGAATTCGAATTC含口的基因的DNA片段呎AfwnlCD限制酶的应用特点 在获取目的基因和切割载体时通常用同种限制酶，以获得相同的黏性末端。但是如果用两种 不同限制酶切割后形成的黏性末端相同时，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起 来。2为了防止载体或目的基因的黏性末端自己连接，可用不同的限制酶分别处理目的基因和载体, 使目的基因两侧及
7、载体上具有两个不同的黏性末端五种酶的比较作用底物作用部位形成产物限制性内切酶DNA分子磷酸二酯键黏性末端或平末端DNA连接酶DNA片段磷酸二酯键重组DNA分子DNA聚合酶脱氧核苷酸磷酸二酯键子代DNADNA解旋酶DNA分子碱基对间的氢键脱氧核苷酸单链RNA聚合酶核糖核苷酸磷酸二酯键核糖核苷酸单链三、基因工程的操作步骤1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定1、目的基因的获取获取目的基因的方法：1直接别离法从基因文库中获取目的基因将含有某种生物不同基因的许多DNA短片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库
8、。包括基因组文库和cDNA文库。直接从基因组中获取目的基因最常用的方法是：“鸟枪法”。2人工合成法化学合成法：片段较小，核苷酸序列已知的目的基因，直接利用DNA合成仪用化学方法合成，不需要模板。反转录法：以RNA为模板，在逆转录酶作用下合成目的基因DNAcDNA。4利用PCR技术扩增目的基因PCR技术：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。由于PCR过程在高温下进行， 因此需要使用热稳定的DNA聚合酶。目的：通过指数式扩增获取大量的目的基因前提：要有一段已知目的基因的脱氧核苷酸序列，以便合成引物。2. 基因表达载体的构建_基因工程的核心(1) 目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，
9、并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达 和发挥作用。丽壬 RNA聚合酶识别和结合部佼,i-io基因表达栽体镇式图重组DNA分子(重组质粒)因导入受体细胞 目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。转化的关键是 目的基因整合到受体细胞染色体基因组中。金榜P185物种类用方法:体细胞转 化 过 程植物细胞农杆菌转化法体细胞动物细胞显微注射技术微生物细胞感受态细胞法受精卵. 原核细胞将目的基因插入到Ti质粒的T将含有目的基因的表达载体DNA上农杆菌导入植物细胞提纯取卵(受精卵)显微 f整合到受体细胞的染色体DNA注射受精卵发育获得具有新性状的动物Ca2+处理细胞f
10、感受态细胞 f重组表达载体与感受态细 胞混合f感受态细胞吸收DNA分子4.目的基因的检测与鉴定目的基因 是否插入燮里I O1RNA |踊译蛋白质个体体杂交抗虫、抗病 接种实验是否出现 杂交帯是否出现杂交带是否出现杂交帶是否抗虫； 是否抗病个体水平检测分子水平检测误区警示(1) 标记基因的作用一一筛选、检测目的基因是否导入受体细胞，常见的有抗生素抗性基因、发光基因(表达产物为带颜色的物质)等。(2) 受体细胞常用植物受精卵或体细胞(经组织培养)、动物受精卵(一般不用体细胞)、微生物(大肠杆 菌、酵母菌)等。要合成糖蛋白、有生物活性的胰岛素则必须用真核生物酵母菌(需内质网、高尔基 体的加工、分泌)
11、；一般不用支原体，原因是它营寄生生活；一定不能用哺乳动物成熟的红细胞， 原因是它无细胞核，不能合成蛋白质。(3) 基因表达载体中，启动子(DNA片段)H起始密码子(RNA)；终止子(DNA片段)工终止密码子 (RNA)。基因表达载体的构建是最核心、最关键的一步，在体外进行。(4) 目的基因与载体的连接方式有多种，如目的基因目的基因、目的基因载体、载体载体等例 3.以下有关基因工程操作的表达中，正确的选项是 () AA. 用同种限制酶切割载体与目的基因可获得相同的黏性末端B. 以蛋白质的氨基酸序列为依据合成的目的基因与原基因的碱基序列相同C. 检测到受体细胞含有目的基因就标志着基因工程操作的成功
12、D. 用含抗生素抗性基因的质粒作为载体是因为其抗性基因便于与外源基因连接例 4 金榜 P187 T2四、基因工程的应用与蛋白质工程1.乳腺生物反应器与工程菌生产药物的比较(1) 含义： 乳腺生物反应器是指将外源基因在哺乳动物的乳腺中特异表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白。 工程菌是指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系。(2) 两者区别：比较项目乳腺生物反应器工程菌基因结构动物基因的结构与人类基 因的结构基本相同细菌或酵母菌等生物基因的结构与人 类基因的结构有较大差异基因表达合成的药物蛋白与天然蛋 白质相同细菌细胞内没有内质网、高尔基体等细 胞器，产生的药物蛋白可能没有活性
13、受体细胞动物的受精卵微生物细胞导入目的基 因的方式显微注射法感受态细胞法生产条件不需严格灭菌，温 度等外界条件对其 影响不大学习文档仅供参考需严格灭菌，严格控制工程菌所需的温 度、pH 、营养物质浓度等外界条件药物提取从动物乳汁中提取从微生物细胞中提取DNA恻甌加搠加2.蛋白质工程与基因工程的比较金榜P189区别与联系蛋白质工程基因工程过程预期蛋白质功能f设 计预期的蛋白质结构 f推测应有的氨基酸 序列f找到相对应的 脱氧核苷酸序列获取目的基因f构 建基因表达载体f 将目的基因导入受 体细胞f目的基因 的检测与鉴定实质定向改造或生产人类.所需的蛋白质定向改造生物的遗传特 性，以获得人类所需的 生物类型或生物产品结果可生产自然界没有的蛋白质只能生产自然界已有的 蛋白质联系蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程 基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造田卜29舶肛漑砸蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基
