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1、4.2K时间分辨激发发射荧光光谱数据的四维建模检测土壤中多环芳烃Hec tor C.Goicoechea a, ShenjiangYu b, Ant honyF.T.Moore c, AndresD.Campiglia 摘要：本文报道一种筛选15种环境保护机构所列多环芳烃的新方法。这种新方法是通过激光激发 时间分辨的Shpol skii光谱收集4.2K荧光时间分辨激发发射数据库（TREECs）。4.2K荧光时 间分辨激发发射数据库（TREECs）来源于自激光激发脉冲的不同时间窗记录的荧光时间分辨激发发 射矩阵的叠加。通过用平行因子算法或展开的偏最小二乘法/三线性残差法（U-PLS/RTL）处理
2、四维 4.2K荧光时间分辨激发发射（TREEC）数据阵，以此解决来自未知的样品伴行物的干扰。这两种办 法很灵敏，可以无需样品预浓缩而在ngg _i到pgg _i浓度级别检测PAHs。它具有的选择性允许实 验过程中省去样品清洁和色谱分离两步。这些特征可降低PAH的损失，缩短分析时间和降低成 本。对每个样本检测15种EPA-PAHs的整个过程仅用250“的有机溶液，所以此方法对环境无 害。1. 引言在多环芳烃的痕量浓度检测分析技术方面人们做了大量工作1T0。这样做的最主要原因之 一是PAHs具有毒性且能致癌。在这种背景下，美国环境保护协会特别关注了 16种PAHs并把它 们列入污染。他们建议监测空
3、气水土壤中的PHAs成分含量，以防止人们接触PHA污染物。监测环境中的EPA-PAHs通常的模式是：清洁样品，预浓缩和色谱分析。样品准备是为了简 化矩阵成分，而PAHs的预浓缩可使其浓度达到色谱分析法能检测到的浓度值。结合吸收光谱和 （或）荧光光谱和气相色谱-质谱仪联用（GC-MS）的高精度液相色谱分析法（HPLC），是当下 EPA分析方法的基础。当用HPLC检测不熟悉的样本时，常常还需运用别的技术比如GC-MS来测 定样本结构11-14。大量样本需要常规检测，而传统检测方法耗时长，这使得更多人关注发展新的筛选技术。统 方法对未被污染样本也需进行仔细检测，而新的筛选技术可以对PAH污染物直接测
4、定给出yes或 no的答案，对无PAH污染样本无需检测，从而降低成本，加快做决定和补救的周转时间。最近 不用色谱分离而直接测定未知成分矩阵中的目标有机物的新的发展趋势是，用二次多元校正法 second-order multivariate calibration method ）处理多维光谱数据15-24。文献25研 究了城市污水样本中的菲和苯并k荧蔥，26研究了地下水、自来水和矿泉水中的苯并a芘和 二苯并a,h蔥，27研究了河水和污泥中的草屈、苯并b荧蔥、苯并k荧蔥、苯并a蒽、苯 并a芘、二苯并a,h蒽，以上的研究都是基于室温荧光激发发射矩阵（EEMs），并同时联用 PARAFAC或者联U-
5、PLS/RBL （用展开的偏最小二乘/双线性残差分解法）。本文研究了土壤中15种EPA-PAHs的直接检测。土壤是PAHs最重要的储藏地之一，PHAs以 气态存在，或者和空气分子相结合在一起，即使地点远离原油工业区。因为PHAs在水中的溶解 度很低，内在化学性质稳定且不易生物降解，一旦进入土壤，PHAs就会长寿命存在而危害污染 环境健康。我们的方法被命名为激光诱导的时间分辨Shpol skii光谱（LETRSS）,在多维格式中 把光谱和寿命信息结合起来，即波长时间矩阵（WTM）32和时间分辨的激发发射矩阵 （TREEMs）33,利用荧光光谱的所有维度。一个波长时间矩阵WTM包括在一个激发波长下
6、记录的一系列发射光谱和激光激发脉冲后不同 的时间延迟。一个时间分辨的激发发射矩阵TREEM是在整个样品荧光延迟阶段的一个特定时间窗 口的激发发射矩阵。在样品荧光或磷光延迟阶段记录WTMs可提供PAHs分辨的另一个参数。光谱 和寿命信息使明确的PAH分辨成为可能。荧光或磷光寿命也报告峰谱纯度，这是不用色谱分离而 准确量化PAHs所必须的34,35。为TREEMs收集而选择准确的时间窗口可提高目标混合物的荧 光性能，而忽略样品污染物的荧光干扰36。在液氮温度下（4.2K）,利用一根低温光纤探针（FOP）进行LETRSS（laser-excited time- resolved Shpol skii
7、 spectroscopy）测量；在几秒钟内准备冷冻样品32-36。降低样品温度 的主要原因是使光谱更细，以便在没有色谱分离的情况下分辨大量EPA-PAHs。我们利用带一个小 程序的低温光纤探针（FOP）对土壤样品进行LETRSS分析37。用FOP容器中微升正辛烷对样品进 行声波降解后，多环芳烃分进入到有机溶剂以便WTM收集。因为样品处理要求称重毫克的土壤装 进FOP瓶，污染风险或PAH损失被限制在最低范围内。FOP的小样品池（750rL ）和小体积的萃取 溶剂使同步提取的众多样本变得更容易。每个样品的整个实验程序用时不到40分钟，包括30分钟 的超声波降解。每个样品的15种EPA-PAHs筛
8、选仅用250rL有机溶剂，因此此方法对环境无害。为了通过4.2K WTM准确分辨EPA-PAHs，分析者检查寿命分析中存在的潜在的干扰。对于成 分未知的样品分析时这一点尤其重要。A single exponen tial decay with a life time equivalent to the lifetime of the pure standard provides a strong argument to claim accurate PAH determination .相当于纯标准寿命的寿命单一指数衰减可以为PAH准确鉴定提 供强有力的论据34,35,37。当我们在4.2K荧
9、光时间分辨激发发射数据库（TREECs）基础上进行 PAH分辨时，我们陈述的方法完全不同的。来自激光激发脉冲的不同时间窗口记录的荧光TREEMs重叠可导出4.2K荧光TREECs。用平行因子算法和U-PLS/RTL处理四维4.2K荧光TREEC数据阵列，由此来处理来自未知的样品伴行物的潜在干扰。在我们研究的文献范围内，这是第一篇关于通过4.2K荧光TREEC结合二阶多元校正法分析 土壤样品的报道。关于PARAFAC或U-PLS/RBL和4.2 K荧光TREEC数据结合也未见报道。仅 有一篇关于用二阶校正法处理高分辨率数据的文章，文中把平行因子算法和4.2K激发被调制磷 光的WTMs(EMWTM
10、s)结合起来。在五个激发波长下记录的五个4.2K荧光WTMs重叠生成EMWTMs。 记录每个WTM使用同样的时间延迟50rs和开门时间1100ms。EMWTMs/PARAFAC方法成功应用于固 相水提取物中的 2,3,7,8-tetrachloro-dibenzo-para-dioxin 的分38。被用来测定15种EPA-PAHs的四维4.2K荧光TREEC数据阵是在纳秒域的荧光衰减中记录的。 TREECs产生于4.2K荧光TREEMs，而4.2K荧光TREEMs是在15种EPA-PAHs共有的一个激发波长范围记 录的。TREEC/四维模型的灵敏度使得无需样品预处理就使得PAHs检测达到的ng
11、g-1到pgg -1水 平。此法得到的回收率与传统办法下获得的回收率相等，进而证明了此方法的灵敏度。2. 实验部分2.1化学药品所有的溶剂是HPLC级别的且从渔民那里购买。若无特别说明，实验中都使用Nanopure水一来 自Barnstead Nanopure Water system.所有的化学药品包括提取PAH使用的是试剂级别的，未做 进一步提纯处理。一个知道成分的土壤样品一自然基体参考材料CRM 104-100 ；来自Elizabe th River南部支流的PAH污染土壤/沉淀物一从资源技术公司收购。来自美国色谱科公司的甲醇PAH混 合液methyl chloride (1:1 v/v
12、)甲基氯，用作HPLC分析时的参考标准。用于LETRSS分析的多 环芳烃标准样从奥尔德里奇购买且为最高可用纯度。罗丹明6G(Rhodamine 6G)由受激发的电子 获得，并根据规范与可调谐染料激光器一起用。注意：由于PAHs有剧毒，使用时要尤其小心。2.2通过经典方法对土壤样品分析用皂化和声波降解法从土壤样品中提取PAH的程序和之前报道的方法一样39。土壤提取物 的HPLC分析也是这样37。皂化和声波降解法程序完整的描述，高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography)分析仪器和、EPA-PAHs色谱分离实验条件可参考本文的 补充信息部分。2.3
13、通过 4.2K LETRSS 筛选 PAH在本文的补充部分由关于LETRSS分析仪器的完整描述。低温FOP在此部分也有论述。在FOP的 试管中将已知重量(0.05g) 土壤样本与250 L的正辛烷混合。室温下在布兰森声波降解法浴器 (3210型)中对此混合物进行30分钟声波降解。沉淀5分钟后，通过LETRSS分析样品提取物。通过 FOP的样品瓶与光纤装置的铜管耦合实现4.2K测量。光纤装置的尖端保持在液体表面0.5厘米以 上。样品冷冻是通过降低铜管进入液态氦里，液氮被存储在60L的杜瓦瓶内。每天处理15-20样本 的情况下，液氮一般可使用3周。每个样品的制冷时间不超过90s。更换冷冻样品包括从
14、致冷剂容 器中取出样品瓶和用热风枪融化冰冻样本。因为测量过程中光纤束的尖端和样品没有接触，测量 期间探针没有必要清理。整个冻结、解冻，和样品的更换周期不超过5分钟。多环芳烃浓度根据多 个标准添加法确定。2.4 TREEC数据阵收集用于分辨PAH的四维4.2K荧光TREEC数据阵来源于四个TREECs叠加，而四个TREECs从含有不同 浓度多环芳烃的土壤提取物中记录的。多环芳烃浓度通过多个标准添加程序来调整。第一 TREEC 反映了土壤样本原始的多环芳烃组成，即没有标准添加。其他的3个TREEC是通过向样品瓶中的250 毫升土壤提取物中添加5、10和15毫升的标准的多环芳烃混合液而得到的，每一次
15、标准添加得到 一个TREEC。所有标准添加在室温下进行。用于生成四个TREECs的4.2 K荧光TREEMs使用激励范围(280 - 295 nm)记录，激励范围对15 种多环芳烃相同。可调谐染料激光器的步长是0.5nm,产生共22个激发波长。在300-500nm范围内 通过使用下列延迟时间(D)记录荧光：10, 30, 60, 90, 120 and 150 ns第一个TREEM的开门宽 度(D=10 ns )是20ns。其他的TREEMs的开门宽度是30ns。这些参数可为TREEM收集提供下列时间窗 口 (D - D+G) : TREEM1=10 - 30ns, TREEM2=30 - 6
16、0 ns, TREEM3=60 - 90 ns, TREEM4=90 - 120 ns,TREEM5=120 - 150 ns, and TREEM6=150 - 180 ns.2.5 化学计量学算法和软件所有计算使用MATLAB 7.640-44,借助MVC3图形工具箱和互联网MATLAB图形界面45。3. 结果和讨论3.1用经典方法分析土壤样品从土壤样品中提取多环芳烃有几种方法(39,46-49)。我们选择甲醇皂化萃取多环芳烃是由于甲 醇皂化萃取效率比较高39。在甲醇条件下皂化可分解有机物的多环结构并增加溶剂对多环芳烃萃 取的可达性，这些有机物经常出现在土壤样品中，化学性质接近多环芳烃。选用的声波降解法方法 由于其萃取时间相对较短且容易实现39,46。声波降解法使用的溶剂一己烷:丙酮：甲苯(10:5:1 v / V / v）已被报道比其他声波
