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1、 . 蛋白质的提取与检测第一节 细胞总蛋白的提取及含量测定【根本原理】蛋白质含量测定法是生物化学研究中最常用、最根本的分析方法之一。目前常用的有四种经典的方法，即定氮法、双缩脲法Biuret法、Folin-酚试剂法Lowry法和紫外吸收法。另外还有两种近年普遍使用起来的测定法，即考马斯亮蓝法Bradford法与二辛可宁酸法BCA法。值得注意的是，上述方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这几种方法测定有可能得出不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：实验对测定所要求的灵敏度和准确度；蛋白质的性质；溶液中存在的干扰物质；测定所要花费的
2、时间。Lowry法：蛋白质与碱性铜溶液中的二价铜离子络和使得肽键伸展，从而使暴露出的酪氨酸和色氨酸在碱性铜条件下与磷钼钨酸反响并产生深蓝色，在750nm有最大光吸收值。在一定浓度围，反响液颜色的深浅与蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量成正比,由于各种蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量各不一样，因此在测定时需使用同种蛋白质作标准。Bradford法：蛋白质与染料考马斯亮蓝G-250结合，使得染料最大吸收峰从465nm变为595nm，溶液的颜色由棕黑色变为蓝色。在一定的线性围，反响液595nm处吸光度的变化量与反响蛋白量成正比，测定595nm处吸光度的增加即可进展蛋白定量。BCABicinchoninic
3、 acid法：二价铜离子在碱性的条件下，可以被蛋白质复原成一价铜离子Biuret reaction并与BCA相互作用产生敏感的颜色反响。两分子的BCA螯合一个铜离子，形成紫色的反响复合物。该水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛围有良好的线性关系，根据吸光值可以推算出蛋白浓度。【试剂配制】1. 1.74mg/ml10mmol/LPMSF：0.174gPMSF溶解于100ml异丙醇，分装于1.5ml离心管中，-20保存。2. 细胞裂解液：50mM Tris-HClpH 7.4，150mM NaCl，1mM PMSF，1mM EDTA，1% Triton X-100，
4、4保存。3. 100mg/ml 牛血清白蛋白BSA：BSA 0.1g，0.15mol/L NaCl 1ml，充分溶解后-20保存。4. 0.15mol/L NaCl：0.877gNaCl溶解于100ml去离子水，高温灭菌后室温保存。5. 考马斯亮蓝G250溶液：考马斯亮蓝G250 100mg，95%乙醇 50ml，磷酸 100ml，加去离子水至1L。先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再参加磷酸和去离子水，混匀后滤纸过滤，4保存。6. PBS缓冲液pH 7.4：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO412H2O 3.63g，KH2PO40.24g，溶解于900ml双蒸水中，用盐酸调pH值至7.
5、4，加去离子水定容至1L，常温保存备用。【操作步骤】一、细胞总蛋白的提取1. 人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231与食道癌细胞系EC109于含10%FBS的DMEM培养基，37、5% CO2条件下常规培养。2. 去除培养液后以预冷的PBS冲洗23遍。3. 参加适量的预冷的裂解液后置于冰上2030min，不时摇动。4. 用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧，转移将细胞碎片和裂解液至预冷的1.5ml离心管中；。5. 4、12 000rpm离心15min。6. 将上清分装至1.5ml的EP管中，-20冻存备用。二、 蛋白含量测定BCA法碧云天P00121. 根据样品数量，按50体积BCA试剂
6、A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时稳定。2. 完全溶解蛋白标准品，取10uL稀释至100uL，使终浓度为0.5mg/ml。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。3. 将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20uL加到96孔板的标准品孔中，加用于稀释标准品的溶液补足到20uL。4. 加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加用于稀释标准品的溶液PBS到20uL。每个样品三个重复。5. 各孔参加200uLBCA工作液，37放置30分钟。也可以室温放置2小时，
7、或60放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显色反响会因温度升高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或延长孵育时间。6.酶标仪测定A562，540-595nm之间的波长也可承受。根据标准曲线计算出蛋白浓度。标准品OD值标准品浓度ug/uL0.07800.0990.0250.1180.050.1540.10.2130.20.2830.30.3290.40.4040.5第二节 SDS-PAGE电泳【根本原理】SDS-PAGE电泳技术SDS polyacrylamede gel electrophoresis首先在1967年由Shapiro建立，1969年由
8、Weber和Osborn进一步完善。当在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶系统中参加SDS后，那么蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，其它因素可以忽略不计。SDS是一种阴离子去污剂，它能破坏蛋白质分子之间以及其它物质分子之间的非共价键氢键和疏水键。在强复原剂如巯基乙醇或二硫糖醇DTT的存在下，蛋白质分子的二硫键被翻开并解聚成多肽链。解聚后的蛋白质分子或其亚基与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，复合物所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同蛋白质分子之间原有的电荷差异，蛋白质-SDS复合物在溶液中的形状像一个长椭圆棒。椭圆棒的短轴对不同的蛋白质-SDS复合物
9、根本上是一样的，但长轴的长度那么与蛋白质分子量的大小成正比，因此这种复合物在SDS-PAGE系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度即蛋白质分子量的大小。当蛋白质的分子量在15200kD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。因此，SDS-PAGE不仅可以别离鉴定蛋白质，而且可以根据迁移率大小测定蛋白质的分子量。【试剂配制】1. 10%SDS：10gSDS参加100ml去离子水中，50水浴下溶解，室温保存。2. 1.5mol/L Tris-HClpH8.8：Tris-base 45.43g，参加200ml去离子水溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，加去离子水定
10、容至250ml，高温灭菌后室温下保存。3. 1.0mol/L Tris-HClpH6.8：Tris-base 30.29g，参加200ml去离子溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，加去离子水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。4. 电泳缓冲液：Tris-base3.03g，Glycine18.77g，SDS1g，参加适量去离子水溶解后定容至1L，室温保存。5. 5Loading buffer：50%甘油，250mM Tris-HClpH6.8，10% -巯基乙醇，2.5溴酚蓝，10%SDS。混匀后，分装于1.5ml离心管中，4保存。6. 10%过硫酸胺AP：0.1g过硫酸胺溶解于1.0ml去离
11、子水，4保存，保存时间为2周。7. 四甲基乙二胺TEMED：分装少量原液于棕色瓶，4避光保存。8. 30% Acr/Bic37.5:1：丙烯酰胺Acr29.2g，甲叉双丙烯酰胺Bic0.8g，参加适量去离子水于37下充分溶解并定容至100ml，4保存。注意：Acr/Bic均具有毒性，易吸附和积累，应戴手套进展操作。9. 凝胶脱色液：500ml乙醇，100ml冰醋酸，加去离子水定容至1L，室温保存。10. 考马斯亮蓝G250蛋白染色液：0.1g考马斯亮蓝G250溶解于100ml脱色液中，混匀后滤纸过滤去除颗粒性物质，置于棕色瓶中室温保存。11. 凝胶保存液：450ml脱色液中参加50ml甘油，混
12、匀后室温保存。12. SDS-PAGE浓缩胶5% Acrylamide配方：13. 别离胶配方【操作步骤】一、凝胶的配制与电泳1凝胶配制与上样1. 玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。2. 配制10%浓度的别离胶，参加TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生，待灌入2/3的别离胶后应立即封胶，用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。3. 胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。4. 配制5%浓度的浓缩胶，将剩余空间灌满后立即将梳子插入浓缩胶中；插梳子时要使梳子保持水平，浓缩胶凝固的过程中要补胶12次。5. 待到浓缩胶凝固后，竖直
13、向上轻轻拔出梳子，用水冲洗一下浓缩胶，将其放入加有电泳缓冲液的电泳槽中。6. 取出含50g蛋白样品与5Loading buffer按比例充分混合，煮沸5min。7. 加足够的电泳液后用微量加样器贴壁上样，注意不要吸进气泡。2电泳1. 以初始电压为80V进展电泳, 30min，样品进入别离胶后改为120150V。2. 在溴酚兰泳动至距胶下缘约1cm时即可终止电泳目的蛋白条带一般跑过别离胶的1/3，可根据预染蛋白Marker调整电泳时间。二、考马斯亮蓝染色1. 电泳后的凝胶于染色液中振荡染色4h或40染色1h，然后用蒸馏水将凝胶淋洗一次。2. 屡次变换脱色液直至凝胶背景脱净为止，为加快脱色，可略加
14、温度。3. 凝胶保存：脱去背风光的凝胶在保存液中浸泡30min，然后将凝胶放在玻璃板上，用保存液浸湿玻璃纸包住凝胶在室温下枯燥即可。第三节 免疫印迹Western Blot【根本原理】Western Blot中文一般称为蛋白质免疫印迹，是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其根本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进展着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。Western Blot与Southern印迹杂交或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，
15、“探针是抗体，“显色用标记的二抗。经过PAGE别离的蛋白质样品，转移到固相载体例如硝酸纤维素/NC膜或聚偏二氟乙烯/PVDF膜上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳别离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反响，再与酶或同位素标记的第二抗体起反响，经过底物显色、化学发光或放射自显影以检测电泳别离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。【试剂配制】1. 电转液：Tris-base 5.8g，Glycine 2.9g，SDS 0.37g，甲醇200ml，去离子水定容至1L，室温保存。2. TBS：20mMTris-HClpH7.4，150mM NaCl，室温保存；3. TBST：即含0.05% Tween20的TBS缓冲液。4. 封闭液与抗体稀释液：均为含5%脱脂奶粉的TBST，溶解后4保存。【操作步骤】一、 转膜1. 将PVDF膜在甲醇中浸泡3min，完全浸湿后置于入转膜液中。2
