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1、 青 岛 农 业 大 学本 科 生 课 程 论 文论 文 题 目 富士苹果红色芽变机理研究 学生专业班级 园艺1002班 学生姓名（学号） 田佳兴（20106188） 指 导 教 师 原永兵 完 成 时 间 2013年12月12日 富士苹果红色芽变机理研究 姓名：田佳兴 指导老师:原永兵【摘要】富士苹果因其具有质优，味美、耐贮等优点，深受人们喜爱，但其色泽一直是发展的限制因素。芽变是种质资源创新的重要途径。本文主要介绍了果树的芽变发生机理，果树芽变机理的研究进展。从生理方面介绍了花青苷的合成途径及调控。通过这两方面的研究进展进行富士苹果的红色芽变机理。 关键词：富士，芽变，花青苷。 富士苹果(
2、Malus domestica Borkh)是世界上最主要的鲜食果品之一,其果实色泽是重要的外观品质,直接决定其商品价值。苹果是很容易发生芽变的果树种类，现有苹果品种中约有10%来源于芽变选种，世界苹果总产量中约有50%源于芽变品种（束怀瑞.1999.107.）。表明芽变已成为苹果重要的育种手段。遗传的变异能够引起富士苹果芽变。芽变是植物产生变异的无限丰富的源泉，既可为杂交育种提供供新的的种质资源，又可直接从中选育出优良的新品种，是选育新品种的一种简易有效的方法。芽变大多在逆境条件下发生，一旦获得则具有较强的适应性，可很快地在生产中应用。目前，对苹果品质的研究主要集中在果形，色泽，糖酸，香气等
3、方面。尤其是近年来随着人们对健康的观念越来越重视，色泽作为果实的重要外观品质，直接导致消费者的购买欲望。因此，如何培育着色好的优良的品种，改善果实着色是育种家，农艺师以及果农亟待解决的问题。1果树芽变发生机理及研究进展1.1果树的芽变 当今，果蔬生产中不少优良品种都是从芽变中得到的芽变是体细胞突变的一种（王昆 等，2007）.芽变（sport）来源于体细胞中自然发生的变异，变异的体细胞发生于芽的分生组织或经过分裂、发育进入芽的分生组织，就形成变异芽。当变异的芽萌发成枝，甚至开花结果以后，直到表现出与原品种的性状有明显的差异时，才容易被发现。芽变包括染色体数目和结构的变异，核内基因突变和核外突变
4、等。芽变变异的性状主要表现包括形态突变、色泽突变、风味突变和成熟期突变。芽变的主要特点包括：芽变的重演性、芽变的嵌合性、芽变的稳定性，芽变的局限性。1.2果树芽变发生机理从细胞学来看，芽变是细胞中遗传物质的突变，只有顶端组织分生层的细胞发生突变时才有可能成为一个芽变。根据Santina和A.F.Blakdee等提出的组织发生层学说来解释果树芽变机理 。以L1、L2、L3表示顶端分生组织的三个独立层次，叫做组织发生层。L1一般是一层细胞，垂周分裂，分化成表皮。L2一般也是一层细胞，垂周分裂，分化为皮层外层，衍生孢原组织。L3有多层细胞，既有垂周分裂又有平周和斜向分裂，分化为皮层的中内层、输导组织
5、和髓心组织。正常情况下，这三层细胞具有相同的遗传物质基础。如果层内或层间不同部分含有的遗传物质发生改变，则经细胞分裂、分化发育后，就会使某一器官表现出一种或多种不同形状，称之为嵌合体。突变发生的时间较早，梢端正在分裂的细胞数较少，突变细胞又处于某一组织发生层的中心处，则形成周缘嵌合体；突变发生时期较晚，梢端正在分裂的细胞数较多，突变细胞又不处于某一组织发生层的中心处，则形成扇形嵌合体，或叫做部分周缘嵌合体（如图1.1所示）。一般情况下，只有L1或L2或L3个别层中的个别细胞发生突变，三层同时发生芽变的可能性几乎是不存在的（景士西，2000）。果树上大部分形成周缘嵌合体的芽变是很稳定的，形状一经
6、发生改变，在生命周期内可通过无性繁殖长期保持。只有极少数的芽变会在生长发育过程中恢复成原有的类型，这就是回归突变。因此果树的芽变有广泛的多样性，有包括花、果、枝和植株形态方面的变异，也有果实成熟期，果实品质、抗性等生理特性的变异。1.3果树芽变机理研究进展目前果树芽变的研究主要集中在染色体结构和数目变异、反转子的插入、DNA甲基化、基因结构和表达差异等方面（陶能国，2006）。1.3.1反转录座子的插入植物基因组的主要成分是反转录座子，以多拷贝形式出现。其转座过程是转座因子的DNA先被转录成RNA，再借助反转录酶/RNase反转录成DNA，插入到新的染色体位点，反转座子通过复制实现转座，增加了
7、转座元件的拷贝数，从而极大地增加了植物基因组的大小。反转座子能通过插入基因附近或内部而导致基因突变或重拍，引起基因表达的失活或改变，因其特有的复制模式，保留乐了插入位点的序列，引起突变的相对稳定。目前基于反转子的标记有SSAP、IRAP、REMAP、RIVP、RBIP。研究发现，反转录转座子广泛存在于果树中。通用SSAP分子标记技术对富士芽变材料和对照的色泽进行遗传鉴定，发现芽变材料中的国色变异很可能是由于反转座子插入CHS基因启动子，导致CHS基因表达异常，从而引起整个花青素合成途径的改变，果色变异（王江波，2013）。Kobayashi等研究发现两个红色葡萄品种均是逆转座子诱导形成;Bre
8、to等在柑橘上也检测到了因逆转座子而导致的芽变现象。1.3.2DNA甲基化状态的改变植物的生长发育反应是通过内源基因的转录来调节的，DNA的甲基化是这一类调节的主要调控方式。DNA甲基化其作用是C导致基因失活，DNA甲基化程度越高，基因的表达活性越低，基因的5端和3端往往含有甲基化位点，启动子上的DNA甲基化密度与基因转录受抑制的程度密切相关.（朱玉贤等，2007）DNA甲基化可以通过有丝分裂和减数分裂遗传（Parketal,1996）。DNA甲基化在果树中的现象也普遍存在，其状态时产生压扁的另一个原因（陶能国，2006）。邓秀新等（2005）应用甲基化敏感扩增多态性（MSAP）技术对24个脐
9、橙品种胞嘧啶甲基化模式和程度进行评估，发现DNA甲基化在脐橙中发生频繁，且品种之间的甲基化存在较大差异。1.3.3基因结构的突变 基因结构的突变可以根据发生突变的基因的不同分为以下两种类型：一类是编码代谢途径中的酶结构基因的突变，导致酶活性的改变或丧失。王江波（2013）。发现富士苹果芽变材料中的红色变异是花青素合成途径中的关键酶CHS比对照多出一个片段。另一类突变的发生是由于在编码转录因子的调节基因中，调节编码区的差异能够引起转录因子结构的微小变化，可使植物性状表现出明显不同（Schwinn etal，2006）.基因的调控区突变能够引起调节基因表达水平的改变进而造成性状的变化。红肉苹果Md
10、MYB10启动子中有多个重复序列，重复序列的个数决定了MdMYB10的表达强度，进而影响红肉苹果的红色程度（Espley etal,2009）,而白肉品种中不存在该重复序列。1.4果树芽变的鉴定果树“芽变”鉴定的方法主要形态学鉴定，孢粉学鉴定，同工酶鉴定、分子标记鉴定等。形态学鉴定，一般的芽变鉴定方法有细胞体积和器官形态的鉴定，通过观察发现形态发生改变后，才能进一步进行嫁接鉴定或者移动栽培鉴定。孢粉学鉴定，通过观察花粉的形态来鉴定。同一类型或品种的基本形态特征是比较稳定的，因此该种鉴定方法应用于不同品种的的鉴定。同工酶鉴定，同工酶可以成为生物品种鉴别，性状早期预测和遗传分析的确切天然标记。同工
11、酶是基因表达的直接产物，可以很直观的反映出品种间的基因差异。分子标记技术，是对生物体的遗传物质的多态性为基础的遗传标记。分子标记技术对芽变材料进行检测可不受环境，取材部位，发育时间的影响，甚至可检出单基因的变异。目前应用于果树芽变鉴定的DNA分子标记技术有RFLP、AFLP、RAPD等。2.花青苷的生物合成和调控 苹果果实果皮的着色与花青苷含量和成分密切相关；苹果果皮中主要含有的花青苷是花青苷-3-半乳糖苷，也含有少部分的花青苷-3-阿拉伯糖苷和花青素-7-阿拉伯糖苷。因此，要研究富士苹果的红色芽变，就必须深入对花青苷的合成途径和调控因子的研究。2.1花青苷生物合成途径花青苷对果实、花和种子的
12、颜色起重要作用（Regan et al，2001;Schaefer et al,2004）。它是由酶催化产生的此生代谢产物，统称为类黄酮。苹果果实着色与花青苷的含量和成分密切相关(Honda et al.2002）。花青苷的生物合成途径已经研究得比较清楚。花青苷是由植物的次生代谢途径苯丙烷类代谢产生。苯丙氨酸是花青素生物合成的直接前体，苯丙氨酸到花青素要经历三个阶段：第一阶段由苯丙氨酸解氨酶（PAL）催化苯丙氨酸肉桂酸的反应，而后又在肉桂酸羟化酶（C4H）和香豆酞CoA连接酶（4CL）的催化下形成香豆素-CoA；第二阶段由香豆素-CoA与丙二酰-CoA在查尔酮合成酶(CHS)的催化下形成黄色的
13、4-羟查尔酮，4-羟查尔酮异构酶（CHI）催化4-羟查尔酮形成4,5,7-三羟黄烷酮，第三步在黄烷酮-3-氢化酶（F3H）的作用下柚苷配基转化成DHK，DHK又在类黄烷酮-3-氢化酶（F3H）的作用下形成DHQ，DHQ经二氢黄酮醇-4-还原酶（DFR）还原成无色花青素双加氧酶（LDOX）,合成有色的花青素。最后，由UFGT进行糖基化反应，花青素与单糖通过糖配基结合形成稳定的花青苷，最后通过转移酶运送到液泡中。2.2光照对花青素生物合成的影响在影响花青苷合成的环境因子中，光照的影响能力尤为突出。花青苷的合成受光照的光强和光质影响。用160mol.m-2.s-1的光照强度连续24小时对离体富士苹果
14、进行光照，发现果皮花青素的含量有所增加（王中华 等，2004）。在苹果中，对花青苷合成起作用的光质有紫外光A，紫外光B、蓝光、红光和远红（原永兵等，1995）。2.3温度对花青苷生物合成的影响温度是影响花青苷合成的另一重要环境因子。主要影响花青苷合成和积累。在一定范围内，花青苷浓度与温度呈正相关（李跃等，2007）。在开始着色后的7-21天在20的条件下葡萄果皮花青素的积累和VvmybAL基因的表达水平，进而促进果皮中的花青素积累（Takos et al；2006）。2.4套袋对花青苷生物合成的影响 套袋是影响果实着色的另一措施。苹果的色泽主要是由叶绿素、胡萝卜素、花青苷及可溶性桃水化合物的含
15、量影响。在果实生长前期，套袋能够抑制富士苹果果皮中叶绿素的合成速度；在后期，套袋又促进叶绿素的降解。套袋苹果果皮的花青苷含量和叶绿素含量的变化有助于着色（程存刚等，2002）。2.5花青苷合成的调控植物花青苷生物合成受两类基因的共同控制：一类是结构基因，编码生物合成途径追踪所需的酶，不同种植物中具有较强的序列同源性。另一类是调节基因，决定花青苷积累的时间和分布。花青苷生物合成途径中所需的酶为：苯丙氨酸解氨酶（PAL）查尔酮合成酶（CHS）、查尔酮异构酶（CHI）、黄烷酮-3-羟化酶（F3H）。调控花青苷合成的转录因子一般包括四个功能域：转录调控区，寡聚化位点、核定位信号和DNA结合区。目前已分离和鉴定的参与花青苷合成调控的转录因子主要包括bHLH、MYB、和WD40三类（Ramsay and Glover，2005）。3.本研究的目的意义苹果果皮的颜色主要是果皮的花青苷含量决定的，花青苷生物合成是是一系列的酶促反应。因同种酶在不同物种中的表现不同导致不同植物的红色调控发育生理机制也有所不同，苹果上花青苷和成与相关酶的关系有待进一步明确。自然界中有许多芽
