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1、Flowjo是目前最受欢迎的流式数据分析软件，因为它简单易用并且十分有效。 则本文将其基本操作以及对细胞凋亡和细胞周期的Protocol分享给大家。1.打开Flowjo软件双击桌面FlowJo软件图标，进入软件工作台。软件工作台由菜单栏、常用工具栏、组空间和样本空间组成。2. Flowjo分析单标样本单标记样本数据常用的显示方式是单参数直方图。通常横坐标可以是线性标度或 对数标度，代表着所检测的荧光或散射光的强度；纵坐标表示的是横坐标某一特 定荧光强度的细胞数，有时也用相对百分比来表现。以3 color comp文件夹中的CyPE comp.fcs进行分析演示。将此文件夹移至 桌面，并把该数据
2、文件夹从桌面拖入Flowjo中的组空间中。在组空间中单击选中“3 color comp”组，此时在样本空间里显示“3 color comp”组中的所有样本。而后在样本空间中双击“Cy5PE comp.fcs”，出现 图形窗口。此为二维点图，X轴选择SSC（侧向散射，细胞内颗粒结构越复杂，质量越大， SSC越大，反之越小。）Y轴选择FSC （前向散射，细胞越大，FSC越大；反之 越小。） 选择设门工具（矩形门亶L椭圆门、多边形门若、自动门房）中的任意 一个，在二维点图中选中淋巴细胞。在图形窗口中双击选中的淋巴细胞，生成新的图形窗口。在X轴选择Cy5PE:CD4，Y轴选择Histogram，选择设
3、门工具（区域门一、双分门1 ）中任意一个， 在单参数直方图中设门。可回（.到JM 购H111m，心号gjNGiWE： 0GD4 r工J* HWlw * 整 mI lALttifeg gzj Jtgj la.B-w3. Flowjo分析多色标样本多色标记样本，包含双标记、三标记及以上的样本。横坐标和纵坐标分别代表与 细胞有关的两个独立参数，平面上的每一个点表示具有相应坐标值的细胞。以三标记样本为例，选择3-color-experiment文件夹中的 931115-B02-Sample01.FCS进行分析演示。同样，在在样本空间中双击“931115-B02-Sample01.FCS”样本，出现图形
4、窗口，显示为二维点图。X轴 选择FSC，Y轴选择SSC。然后选择多边形设门工具，拦，在二维点图中选中淋 巴细胞。双击淋巴细胞门，出现图形窗口，X轴选择Fluor:CD3，Y轴选择FSC。使用矩形设门工具1 n I选中CD3阳性细胞，设门并命名为T细胞。Fluor皿 甲USM双击T细胞门，出现图形窗口在X轴选择Cy5PE:CD4 ,Y轴选择PhyEry:CD8 , 使用十字门工具十设门（拖动鼠标将四分门移到目标位置即可，一般根据细胞 分群的趋势，四分门的界定线可设在阴性、阳性细胞的分群处），如下图所示：Q1 : CD8单阳性细胞，为CD8+ T细胞Q2 ：双阳性细胞Q3 : CD4单阳性细胞，为
5、CD4+ T细胞Q4 ：双阴性细胞4. Flowjo检测细胞凋亡 细胞凋亡又称细胞程序性死亡，有别于细胞坏死。细胞凋亡是指在生理病理情况 下机体为维护内环境的稳定，通过基因调控及酶的参与下，使一些衰老细胞高度 有序的自动死亡过程。Annexin V-FITC/PI双标记法检测细胞凋亡是实验室常用 的一种方法。通常Annexin单阳性的细胞的话，就是凋亡早期细胞，如果 Annexin, PI双阳性的话，即是坏死细胞。将凋亡样本拖入Flowjo，双击原始数据打开图形窗口。X轴选择FSC-A，Y轴 选择SSC-A。分析凋亡的细胞选择上图所示的细胞群体进行分析。细胞碎片不 予分析。在SSC/FSC图中
6、双击“分析的细胞群体”，X轴选择FITC,用来表示AnnexinV-FITC。Y轴选择PE-Texas,用来表示PI。用四分门设门工具界定活细 胞和凋亡细胞。如下图所示：Q1 : (AnnexinV-FITC)-/PI+，此区域的细胞为坏死细胞。也可能有少数的晚期 凋亡细胞在其中，甚至机械损伤的细胞也包含其中。Q2: (AnnexinV+FITC)+/PI+，此区域的细胞为晚期凋亡细胞。Q3 : (AnnexinV-FITC)+/PI-，此区域的细胞为早期凋亡细胞。Q4 : (AnnexinV-FITC)-/PI-，此区域的细胞为活细胞。通常统计细胞凋亡率时采用Q2+Q3，晚期凋亡+早期凋亡群
7、(即所有AnnexinV 阳性群)。5?5. Flowjo检测细胞周期细胞周期的检测是流式细胞仪最为广泛的应用之一。细胞周期是指以有丝分裂方 式增殖的细胞从亲代分裂结束到子细胞分裂结束所经历的过程。通常由G1期、 S期、G2期和M期组成。细胞在G1期完成必要的生长和物质准备，在S期完 成染色体DNA的复制，在G2期进行必要的检查和修复，以保证DNA复制的 准确性。在M期完成遗传到子细胞中的均等分配，使细胞进行分裂。细胞周期检测中PI最为常用。PI为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入核酸 DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与DNA的含量成正比 例关系，用流式细胞仪进行分析，就可
8、以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状 态，从而计算出各个期的百分含量。以cell cycle文件夹中的5206.001，PI标记为例，设门选取目标细胞群体，将 细胞碎片排除在外。即双击工作台中的5206.001样本，打开图形窗口。X轴选 择FSC-H，Y轴选择SSC-H，细胞碎片位于左下角的位置，设门选中目标细胞， 如下图：设门选中要进行细胞周期分析的单细胞群体，排除粘连细胞(粘连在一起的双细 胞或多细胞团块等)的影响。X轴选择FL2-W(width)，Y轴选择FL2-A(area)， 设门方式如下图：BD的流式仪采集的数据:在进行周期分析的时候，通常是采用FL2-A与FL2-W（或者FL2-
9、A与FL2H）进行设门。Beckman的流式仪采集的:X轴选择FL3-LIN,用来表示PI的线性信号。Y轴选择FL3-PEAK,用来表示PI的峰值信号。设门方式如下图:在FlowJo工作台中选中“单细胞群体”这个节点，在菜单栏的“工具”中选择 细胞周期”，打开周期分析窗口。得到G1期、S期、G2期细胞百分比，G1期CV值和G2期CV值等数据。、眼gH坚底二、-KM、撤燎欧秘gZEVIDMU &二ool tss 3gsIEVODtts。匡ffiTRYg长辰反划曲寐日施柬明壮巨 B$M。15W ou) u。撤szkgtef啪菜眼s sCNEylo-撤0&、6 gtngspgss0S3 - qqOO)SIA sawosslsas oin oasssalsssffis assHtmafsh、3BC岂L3EJ? ii ,-SWT& CS-.-3._s套ls 菖Hs口 昌口，日 巳一41口邕旧 Eisr*映onU8爵-s 或 5 r r 器甚*中葛日，匕皇- 胃.；用一击bEEB els sIM，： & 另荔EWE置为 - ac;e55 禺仍r as s 翌新EI wfDS My 3- 页b5E = -jJ.l-
