《hBMP和hFGF双基因共表达重组腺病毒载体的构建及鉴定》由会员分享，可在线阅读，更多相关《hBMP和hFGF双基因共表达重组腺病毒载体的构建及鉴定（65页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、广东医学院硕士学位论文hBMP-2和hFGF-2双基因共表达重组腺病毒载体的构建及鉴定姓名：刘思景申请学位级别：硕士专业：指导教师：郭伟韬202105hBMP-2和hFGF-2双基因共表达重组腺病毒载体的构建及鉴定中文摘要【目的】构建人骨形态发生蛋白2 m瞰啪bone删哪)hog髓而c pm钯酢2，hB砌-2)和人 成纤维细胞生长因子2彻珊觚fib袖last朗)、砒自咖r2，hFGF-2)双基因共表达重组腺病毒载体，并对其鉴定，为后续基因治疗和细胞移植实验提供实验根底。【方法】通过引入内部核糖体进入位点序列(砷舶讨幽鲫鹏咖s娩，眦S)，采用基于九噬菌体位点特异性重组系统的Q眙wa伽技术构建带有
2、hB御2和hFGF2双基因共表达重组腺病毒载体。用聚合酶链式反响(polyl蝴chain豫厕册，PCR)方法扩增hBMP2和hFGF2目的基因，将两个基因亚克隆至p琢匠S2EGFP中，构建邮MP2-琢正S城7GF2，菌落PCR、双酶切电泳及测序鉴 定。通过BP反响将hBMP2冱ShFGF2重组到载体pH3Nl也21中，再通过LR 反响将其转移到腺病毒载体岫CMV5DEST中。测序鉴定重组成功后将其线性化，脂质体转染线性化的重组腺病毒载体于293细胞以包装制备重组腺病 毒Ad-hBMP2Il冱ShFGF2。重组腺病毒经PCR鉴定之后反复感染293细胞进 一步扩增并纯化。通过免疫法测定腺病毒滴度。
3、【结果】成功扩增出hBMP2和hFGF-2基因片段，phBMP2琢正S枷PGF2经菌落PCR、 双酶切及测序鉴定正确。提取重组腺病毒基因组成功扩增出外源目的基因 hBMP-2和hFGF2片段，重组腺病毒在293细胞中包装成功，获得成熟的病毒颗粒，测得病毒滴度为282101岫。【结论】，成功构建携带hBMP-2和hFGF2双基因共表达重组腺病毒载体，收获的病 毒具有较高滴度，为以后利用腺病毒载体进行hBMP2及hFGF-2双基因共表达 干预骨修复的体外及体内研究提供实验根底。【关键词】人骨形态发生蛋白2；人成纤维细胞生长因子2；腺病毒载体；内部核糖体 进入位点序列。2Construction a
4、nd identi矗cation of recombinant adent丽rus Vectorco-expIIessing hBA们睢2 and hFGF-2 genes【obj佻倚嘴】T0伽ls嘲me舢mbin碰础枷v铆渺exp煅s她llB凇andhFGF2 g饥esandt0豫诹me鲥矧舢mbin觚鸭鹪屯0layaf0嘁蜥for恤跚bq啪t ge鹏t11e婶y锄dIl蛔nspl锄蜘0f锄砌懿联痂nents【Me伍ods】T0 cc咄删the坞cOmb硫副Ic|加咖s wcl册吒x衅ssing h】弧肛，2锄dhFGF2 g锄陷dqpelldh唱iI此mal rib0鲫m咖si屯e(眦S)
5、暇lll髓by九ph嬲ge-s沁speci舭玎渤mbhlati蛆蹈Stcmsm hB2锄d hFGF-2 ga螂袱鹏锄pli6ed by PCR and砌，cl伽ed in的me幽醐谢p也S2-EGFP锄d也ep11BMP2琢匝S坷GF2 pl鲫mid w潞0b切IinedIk pl锄id w弱俩丘ed b，rlyPCKdouble digesti锄d嘣lue批啦It w船gubcled i咖呻V衄p舢2lby BP麟娟锄d subc妇树int0那么删5-DEST Vec瞬by LR暇触凹being v砌ed byqu锄c吣，thccom蛐ad伽【o、，inIs ve咖r pl；嘲面d w弱l
6、in此E砷ed锄d由ms诧ed int0 293lls by Hpofect鲫曲舱f-0r p习ucl【agingThe 坞combi】嗯nt鲥蛔的vinls we他fIlrth盱锄叩li矗caled锄d p耐丘ed 加 PCR ide砸氖洳啊硷丘nal virIls plolu幽嗍tit髓脚by i珏皿mni勿蝠on【R鹪u】1k hBMP2粕d hFGF2 gen豁we愆飘Jcc销sfIllly锄plified by PC&1khBMP2通S制FGF2cutting趾d踟燃吣m嗽删访邶脯删byplj枷d w瑟cO栅衄1ed by col册y PCRdouble册d：ucl朗PCR ofex
7、ogen沁hB姗2 趾d hFGF2掣嬲 觚d 嗍 packaged m删址novi鹏sucssfIllly，也e tit盯0f Ad-hBMP2汪S-hFGF2 w撼2821010m妇缸【Conchsions】椭慨砌ch may o脑也e棚of in、，iv0 eXp蛐0fR。c锄bi船nt AdhB加P2-琢置ShFGF2 w舔鳓lcces娟ll】y c0岱hucted wi也a higllin劬觚dhBm and hFc0啾pressing fof孵帅of陀删吡3【Ke，r wo岫】。，hu瑚n BMP2 gc舱；hum觚FG】P2 gene；adcno妇憾ve曲弼砷胁al mome呻s
8、ite4l前言11研究背景外伤、感染、肿瘤的切除等因素造成骨缺损、骨不连，其治疗在骨科 领域一直是棘手的难题。美国每年大约有650万骨折患者，骨延迟愈合、 骨不连及骨肿瘤和创伤造成的骨缺损占1015左右。随着经济的开展、交 通事故的增多，在中国骨缺损的患者也日益增加，现已成为严重影响人民 生活质量的主要疾病之一，给社会带来沉重的负担。骨不连、骨缺损传统 的治疗以自体骨移植为主，但是自体骨来源有限，并且会对供区造成新的 骨缺损。尽管国内外也开始使用同种异体骨，然而异体骨有免疫原性、潜 在传染病原体的危险，而且价格昂贵。金属类、合成塑料类、陶瓷类以及 硅橡胶等人工材料由于缺乏骨诱导性而难以在临床推
9、广使用。因此探索新 的方法提高骨愈合和促进骨形成是治疗骨缺损、骨不连的最正确途径。近年来，基因治疗的研究成为骨组织工程学研究的焦点。通过基因治 疗将骨诱导因子基因导入特定部位，持续表达细胞因子并以自分泌旁分泌 形式诱导骨再生，将使骨缺损、骨不连的治疗发生革命性变化。骨不连、 骨缺损的治疗需要多种细胞生长因子的参与，在众多的生长因子中，以 BMP2和FGF2的研究较为广泛。目前国内外关于BMP2基因治疗的研究 也正成为热点，骨形成蛋白具有诱导未分化间充质细胞向软骨细胞和成骨 细胞方向分化、进而形成新骨的能力【l以J，在骨折和骨缺损的修复过程中发 挥着重要作用。随着基因工程技术的开展，多种动物骨形
10、态发生蛋白基因 被克隆和测序，现已发现近20个亚型，其中骨形态发生蛋白2具有较强的 成骨能力，有学者利用基因工程技术对其基因进行克隆和表达，制备出重 组人骨形态发生蛋白2进行骨修复的研究和临床应用【3羽。侯锐【71等用重组 人骨形态发生蛋白2复合骨髓间充质干细胞及珊瑚构建的组织工程骨移植 到新西兰兔颅骨缺损处，16周后颅骨缺损得到有效修复强于未复合的对照 组。焦鲲【8】等以胶原海绵为支架，用含腺病毒介导的骨形态发生蛋白2的鼠 肌母细胞修复小鼠胫骨缺损，9周后骨缺损完全消失，明显优于对照组。hFGF2是纤维细胞生长因子家族成员之一，它能诱导多种细胞分化、 增殖，促进血管系统形成，参与组织的创伤修
11、复，是重要的创伤愈合因子 之一。郑启新【9】等体外将FGF2基因转入骨髓问充质干细胞并与B磷酸三 钙多孔基质材料复合移植，修复同种异体兔桡骨长节段性骨缺损。结果表 明实验组骨缺损正常修复，有大量活泼的新骨及丰富的毛细血管生成；且转 基因细胞可持续表达FGF2至少4周以上。FGF2在促进血管形成的同时 还具有增强骨修复的作用，米雷【lo】通过聚乳酸一聚羟基乙酸共聚物成纤维细胞生长因子微球和磷酸钙骨水泥混合，制造出一种新型的人工骨修复材料，与体外培养的同种异体骨髓间充质干细胞共培养后对动物大段骨缺损 进行移植修复。核素骨扫描结果示前8周为快速开展阶段，812周已进入 缓慢开展渐趋成熟阶段，骨代谢活
12、性即成骨能力和血管化程度是实验组优 于对照组。研究发现BMP2和FGF2能共同提高骨髓间充质干细胞的成骨 能力【11-131，杜俊杰【14】等研究发现FGF2可提高重组人BMP诱导成骨中I 型胶原mRNA及碱性磷酸酶的表达。近年来已有学者开始利用两者进行协同治疗，砧锄【】等将5pg重组人BMP2250衄3聚乳酸明胶海绵植入兔的下颌骨下缘，实验组的新骨形成和FGF2表达高于对照组。 目前基因治疗研究最多的是单基因治疗，远远不能满足治疗的需要。国内外也有研究双基因转染BMSC治疗骨缺损，但大多是将两个目的基因 分别构建在不同的载体上，以至于两个基因总表达效率低下，利用多启动 子表达载体进行多基因治
13、疗，需要的载体过于庞大，操作困难。双基因的 融合表达的方法可能因蛋白的结构相互作用而影响其功能。由于pIRES双 基因表达载体含有内部核糖体进入位点(intemal ribome ent巧sites，IRES) 序列，具有内核糖体进入位点的功能，能将其上下游基因共同转录【l们，故 可将通过Il冱S连接在一起的BMP2和FGF2同时转录成一条单链mIA， 再各自独立的进行翻译和表达，保证了II江S上下游基因共同的高表达。基因治疗也应考虑选择平安有效的载体系统，在骨修复的研究中，选 用复制缺陷型腺病毒载体，目的基因在体内表达的时间持续数周或数月后 消失，正好符合骨修复基因治疗的要求。不用担忧持续的
14、过度表达引起骨 质增生过度、以及可能的致瘤性。此外，腺病毒不整合到宿主细胞的基因6组中，无插入突变危险；它允许两种以上基因同时引入，满足骨修复过程 中对多种细胞因子的需求。因此，腺病毒是骨修复研究中较为理想的基因 表达载体。Gate啪y克隆技术是利用九噬茵体DNA自然条件下可与其宿主大肠杆菌DNA发生位点特异性重组整合和可逆切割别离这一机制并加以改进 创立的。相对酶切构建载体来说，该技术具有需时短、操作简单， 即只需 通过简单、高效的BP和LR反响就可实现把PCR产物定向转入克隆质 粒和表达质粒，实现PCR产物在各种质粒间的转移。已有多项研究成功地 利用Gateway克隆技术进行载体的构建和表达【17-1们。12 研究目的实验以骨组织工程中种子细胞的成骨化和成血管为研究的出发点，拟 通过PCR的方法获得hBMP2和hFGF2基因，采用GatIe
