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1、实验五果蝇唾液腺染色体的观察及制备一、目的1掌握剖离果蝇幼虫唾液腺的技术。2. 掌握制作果蝇唾液腺染色体玻片标本的方法。3. 观察果蝇唾液腺染色体的形态特征。4. 了解体细胞染色体联会现象。二、原理1双翅目昆虫（摇蚊、果蝇等）幼虫期的唾液腺细胞巨大，其中的染色体 称为唾液染色体（salivary chromosome）。这种染色体比普通染色体大的多， 宽约5ym，长约400 ym,相当于普通染色体的100150倍，因而又称为巨型 染色体。唾液腺染色体经过多次复制而不分开，大约有1 0004 000根染色 体丝的拷贝，所以又称多线染色体（polytene chromosome ）。多线染色体染
2、色后，出现深浅不同、疏密各别的横纹，这些横纹的数目和位置往往是恒定的， 代表着果蝇等昆虫的很多特征。例如染色体有缺失、重复、到位、易位等，很 容易在唾液腺染色体上识别。2黑复果蝇的唾液腺染色体是2n=2*4=8（图一），但因体细胞配对，又因短 小的第4染色体和X染色体的着丝粒在端部所以染色体的一端在染色中心上， 看上去，各自只形成一条线状和点状染色体。只有第2和第3染色体的着丝粒 在中央，它们从染色中心以V字形向外伸出（2L，2R，3L，3R），因此共有6 条（图二）图一图二在显微镜下，短小的第4染色体有时不易观察到，所以最容易识别的是第5 （图三）雄果蝇的Y染色体几乎包含在染色中心里，因为是
3、异染色质，看起来 很淡。唾液染色体上的横纹宽窄、浓淡是一定的，但在果蝇的特定发育时期， 它们会出现的膨胀，这称为疏松区（puff）,目前人们认为这是这部分基因被 激活的标志。图三胞中同源染色体处于紧密配对状态的复制中仍不分开：由此成千上万1，这条核 类存在于双翅目3. 唾液腺染色体的另- 种状态称为“体细胞联会”。 蛋白纤维丝唾液腺染色体(salivary gland chromosome)是 昆虫，如果结合在一起，紧密盘绕。所以细胞中染色体只呈单倍数。黑腹果蝇的 染色体数目2n=8其中第II、第III染色体为中部着丝粒染色体，第W染色体和第IX染色体为端着丝粒染色体。唾液腺染色体形成时，染色
4、体着丝粒和近着丝粒 的异染色质区聚于一起形成一个染色中心(chromo-ce nt er)，所以在光学显微 镜下可见从染色中心处伸出6条配对的染色体臂，其中5条为长臂，l条为紧靠 染色中心的很短的臂。唾液腺染色体经染色后，呈现深浅不同，疏密各异的横纹(band)。这些横纹的数目，位置，宽窄及排列顺序都具有物种的特异性。研究认为这些横纹与染色体 的基因是有一定关系的。通过一定的实验方法使果蝇唾液腺染色体各臂分散开， 并且使带纹、膨突等特征不受杂质影响清晰地显示出来，是进行果蝇遗传学研究 的很重要的一个环节.果蝇唾液腺染色体在不同种间的共同点是染色体的着丝点 位于一个染色区域，但不同的种类往往其染
5、色体臂数目不同.每条染色体臂上分 布着染色深浅不同、粗细各异的磺纹(band),这些横纹的宽窄疏密程度以及排 列顺序和数目又都有种的特异性和种内的差异.由此，果蝇唾液腺染色体近几十 年来，已广泛用于种内系统发生和种间亲缘关系的研究中，因为种间及种内不 同品系和近缘种中的遗传差异经常反映在唾液腺染色体的不联会、形成泡 (puff)、缢虞(constrietion)和间带区的伸缩性以及顶体(telomere)的形态等多 方面的差异，而特别重要的是研究它的基因序列的差异(观察是否产生了例位以 及染色体的断裂、融合和重排).因此，无论从细胞遗传学的角度研究基因与突 变性状之间的联系，还是从进化遗传遗传
6、学方面研究染色体的系统发生，探讨种 间以及近缘种间的遗传差异和生殖隔离的机制等，唾液腺染色体的分析研究都是 十分重要的.从其横纹分布特征可对物种的进化特征进行比较分析，而一旦染色 体上发生了缺失，重复，倒位。易位等结构变化，也可较容易地在唾液腺染色体 上观察识别出来。三、仪器设备及材料，试济仪器设备：解剖镜，显微镜，恒温培养箱，镊子，解剖针，载玻片及盖玻片，吸 水纸解剖镜，显微镜，恒温培养箱，镊子，解剖针，载玻片及盖玻片。材料：黑腹果蝇(Drosophila melanogaster )三龄幼虫(选择行动迟缓、肥大、 爬在管壁上既将化蛹的三龄幼虫，利用这样的唾液腺细胞才能制备出理想的染色 玻片
7、标本)(图四)(图四)试剂：醋酸洋红液，蒸溜水，浓盐酸，Ephrussi-beaclle生理盐水四、实验步骤（一）材料准备：在一干净载玻片上滴一滴生理盐水，选择行动迟缓、肥大、爬 在管壁上即将化蛹的三龄幼虫放于生理盐水中（二）剥离唾腺：在解剖镜下左手持解剖针按压住幼虫后端1/3处。固定幼虫， 右手持解剖针扎住幼虫头部口器处，适当用力向后拉，把头部与身体拉开，唾液 腺腺体随之而出，再用解剖针先将含有腺体的一团组织与其它组织分开.然后再 将腺体与脂肪等组织分开.得到果蝇唾液腺。（果蝇的唾液腺是位于口器后端神 经节两侧的一对透明而微白的类似香蕉形的长形小囊，由单层细胞构成。细胞大， 细胞核大，细胞轮
8、廓清晰（图五）（图六）（三）低渗处理：在载玻片上滴一滴低浓度的Nacl溶液对唾液腺处理10-15min, 使其细胞充分吸水而容易弄破。（四）解离：用滤纸吸取低浓度Nacl,再在载玻片上滴一滴lmol/LHCI,让唾 液腺在lmol/L HCI中解离40-60分钟（！），以松软组织，利于染色体分散。（五）染色：解离后的腺体可用水冲洗23次后滴2滴品红染液染色20分钟。（注：解剖和染色过程勿使腺体于燥，在酒精灯上加热以增强染色效果。可以不 经解离一步而直接染色，也可以在将幼虫头部与身体拉开后马上加染液染色，然 后慢慢剖离腺体.）（六）压片：当腺体被染成红色后，用滤纸擦去染液周围一圈的黑色沉淀物，
9、再用蒸馏水冲洗2 3次，然后加上盖玻片，在盖玻片上方再植盖一层滤纸，再 用拇指按住盖玻片用力下压，把腺体细胞压破，把染色体压散开.（注：压片时放载玻片的桌面要干，不要使盖片滑动。制好的玻片标本用蜡封住 盖玻片四周以防干燥。经低温冷冻处理的材料经解离，染色.加盖片后不必敲 击.镜检即可看到分散良好的染色体。）（七）镜检：将制好的片子先用低倍显微镜观察。找到好的染色体于视野中心, 再用高倍镜油镜观察。如果制片理想，可做成永久制片。注意事项：1. 一定加生理盐水，否则唾腺易干。2. 水不可太多，否则幼虫会漂浮而且活跃。如水多了，请再剥离唾腺前吸走 些，唾腺剥离后请勿吸水，以防将唾腺一起吸走。3. 清
10、除脂肪组织时要量力而行。4. 染色液勿过多，否则压片时唾腺易随染色液漂走。如染色时间到后，染色 液已干，应再少加些染色液，再盖上盖波片，避免气泡产生。5. 压片时要均匀用力，轻敲盖片。五、实验结果：在显微镜下我们看到的结果如下结论：1四对多线染色体的着丝粒区聚合成为一个，从此中心伸出5个长臂和1个 短臂。2.多线染色体中平行排列的染色质在各段凝缩紧密程度不同形成（85%呈带 纹区深染,15%呈间带区浅染）。3每一臂上所有的横纹的大小和位置是恒定的，即具有种的特征。4如染色体有缺失、重复、倒位、易位等，很容易在唾腺染色体上识别出来。六、思考与讨论1何谓线染色体（你重新思考一下）答：1 一种缆状的
11、巨型染色体,见于有些生物生命周期的某些阶段 里的某些细胞中。由核内有丝分裂产生的多股染色单体平行排列而成。各 染色单体上的染色粒（见灯刷染色体）并排排列，构成多线染色体的带， 带与带之间则称间带。多线染色体的这种结构可用光学显微镜观察，也能 在多线染色体上用原位分子杂交法进行基因定位，并就其结构与功能之间 的关系进行系统研究，因此是细胞学和遗传学研究的有用材料。核内DNA多次复制产生的子染色体平行 排列，且体细胞内同源染色体 配对，紧密结合在一起，从而阻止了染色体纤维进一步聚缩，形成体积很 大的由多条染色体组成的结构叫多线染色体。多线化的细胞处于永久间期， 体积也相应增 大，它存在于双翅目昆虫
12、的幼虫组织内，如唾液腺、气管等。2如何区别你看到的就是唾腺染色体？答：（1）由于在唾液腺细胞中8条染色体之间以着丝粒互相连结在一起形 成染色盘或异染中心和同源染色体之间的假联会，经碱性染料染色后，可以观察 到一个染色较深的染色盘和以染色盘为中心向外辐射出的5条染色体臂。（2） 在这些染色体臂上可以看到染色深浅不同，被称做明带、暗带的横纹，这些横纹 的位置，宽窄、数目都具有物种的特异性。不同物种，不同染色体的不同部位形 态位置是固定的。因此根据染色体各条臂带纹特征和各条臂端部带纹特征能准确 识别各条染色体。（3 ）在染色体臂上还可看到某些带纹通过染色体的解旋、膨大 形成的疏松区和巴尔比尼氏环，其
13、富含转录出来的RNA，因此不着色。（4）唾液 腺细胞处于永久早期，染色体解旋呈伸展状态.在幼虫发育过程中细胞核中的 DNA多次复制，但细胞、细胞核不分裂。复制后的染色单体DNA不分开，从而形 成了多线染色体（5 ）每一臂上所有的横纹的大小和位置是恒定的，即具有种的 特征。3在昆虫学中，二龄幼虫，三龄幼虫有何生物学意义？（重新思考）答： 果蝇是完全变态发育的生物之一，二龄幼虫，三龄幼虫是其变态 发育的重要特点。从初生卵发育至新羽化的成虫为一个完整的发育周期，在 25, 60%相对湿度条件下，大约为10天。通过控制养殖的温度，可以加速和 减缓果蝇的发育。果蝇个体很小，幼虫在三龄时达到最大，约2毫米
14、，成年果蝇 也仅为2-3毫米。新羽化的雌性成虫大约8小时之后即可进行交配，交配之后 大约40小时开始产卵，第4-5天出现产卵高峰。性成熟雌性果蝇生殖能力很强, 产卵初期每天可达5070枚，累计产卵可达上千枚。黑腹果蝇是最普遍应用于遗传学的果蝇，也是奠定经典遗传学基础的重要模式生 物之一，对其染色体组成和表型、基因编码和定位的认识，是其它生物无法比拟 的。基于清晰的遗传背景和便捷的遗传操作，果蝇在发育生物学、生物化学、分 子生物学等领域也都占据了不可替代的位置。随着神经科学的兴起，许多遗传操 作在该领域不断发展和成熟，为在果蝇中进行神经科学的研究打下了坚实的基 础。总之，果蝇在近一个世纪以来的生物学舞台上占有举足轻重的地位，在各个 领域的广泛应用使其成为一种理想的模式生物，不论在已往、现在和将来都将为 人类探索生命科学的真谛做出不可磨灭的贡献。参考文献： 图一、图二： http:/ 图三：http:/ 图六：http:/202.207.208.44/jxzx/smkxyjzx/dmtkj/yc/%B9%FB%D3%AC%CD%D9%CF%D9%C8%BE%C9%AB%CC%E5%B5%C4%B9%DB%B2%EC.ppt#266,9,实验原理注意：每个图的标注方法按
