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1、毕业论文：鸡大肠杆菌病病原的分离与鉴定及药敏试验科技学院2013届本科毕业论文（设计）学生姓名：时科所在院係）：动物科学学院 所学专业：动物医学导师姓名： 常 新 耀完成时间： 2013 年5 月鸡大肠杆菌病病原的分离与鉴定及药敏试验摘要鸡大肠杆菌感染是危害养鸡业的主要细菌性传染病，无菌采取南阳市唐河县某鸡场中疑似大肠杆菌病死雏鸡肝、脾、肺等脏器病料，通过结合综合流行病学、临床学、病理学、生物化学和传染病学，进行分离与鉴定，最终确诊为鸡大肠杆菌病。从部分养鸡场分离出的细菌进行药敏试验，通过药敏试验筛选出敏感药物， 为治疗与预防提供理论依据和实际应用参数。The Separation,Ident
2、ification And Antimicrobial SusceptibilityTest Of Chicken ColibacillosisAbstractChicken colibacillosis infection is the major infectious diseases in poultry industry. Sterilely resorting to visceral organs, such as livers ,spleens, lungs of illness, chicklings that are suspected colibacillosis of ea
3、ch large chicken places in Shanxian,by the means of combing with epidemiology,clinical, pathology, biochemistry and epidemiology,we can separate and identificate to diagnose whether it is colibacillosis or not. By the means of form dyeing and Biochemical tests and then antimicrobial susceptibility t
4、est on bacterium that is separated from part chicken places,we can screen some Sensitive drugs and find more effective proprietary to Provide theoretical basis and practical parameters of treatment and prevention.Key words: Colibacillosis ， Separation ， Identification ， Antimicrobial Susceptibility
5、Test目录前 言 1材料与方法01.1材料0病料来源0仪器及设备0培养基与试剂0试验动物11.2试验方1病理剖检 1大肠杆菌的分离鉴定病料采集1分离培养1镜检2生化鉴定2致病性试验2药敏试验22结果与分析221病理剖检222大肠杆菌的分离培养323形态学观察324生化鉴定425致病性试验526药敏试验53讨论631注意种蛋卫生732加强卫生管理733 适当添加维生素和微生态制剂，增强机3.4 免疫预防接种4结论8参考文献8致谢10前言鸡大肠杆菌病是由大肠埃希氏杆菌（Escherichiacoli, E.coli）某些血清型菌 株引起的一类疾病的总称1。大肠杆菌致病性菌株的致病因子主要由该病原
6、体的三个特征所决定：侵袭 力，感染力，致病性潜力。该菌主要有三个原类型，即菌体抗原，表面抗原，鞭 毛抗原。该菌对外界的抵抗能力不强，一般60丈15min便可致死,对一般消毒药的抵抗力也很弱，但常用的消毒药水均能将其杀死2。大肠杆菌病可以引起胚胎死亡、脐炎、败血症、肉芽肿、全眼球炎、气囊炎、 腹膜炎、输卵管炎等一系列病症，是家禽中最常见的病原菌之一3。由于该病在 一些养殖场中严重发生，兽医临床上抗菌药物不得不大量地被应用，导致大肠杆 菌耐药菌株不断出现，耐药谱不断扩大，形成恶性循环；同时加剧了抗菌药物在 畜禽体内的残留，给养禽业的持续发展和人类的身体健康带来潜在危害4。随着唐河县养鸡业的迅速发展
7、与高度集约化饲养，鸡大肠杆菌已成为鸡群中 重要疾病之一。 2012年12 月，唐河六和饲料公司合作某鸡场所饲养的鸡于24 天开始发病，两天之内，死亡21只。病鸡多精神沉郁，食欲减退，腹部膨大， 粪便呈灰绿色或黄色，本实验室对送检的病鸡48 只，病死鸡进行了剖检、病理 学诊断和病原检测，确诊该鸡场发生了大肠杆菌病，筛选出对这些致病菌比较敏 感的几种药物进行治疗，控制疫情。1 材料与方法1.1 材料所有病料来自于唐河六和饲料公司合作某鸡场提供的病鸡，初步确诊为大肠杆菌病，病鸡48只，其中死亡35只，死亡鸡死亡时间不超过24h，其中肉仔 鸡、蛋雏鸡27只，产蛋鸡21只。光学显微镜、恒温箱、高压灭菌器
8、、无菌实验台、微量移液器等（由南阳市 唐河六和化验室提供）。麦康凯琼脂（NA）伊红美兰琼脂、普通肉汤、营养琼脂（NA）验所用的 培养基均参照兽医微生物实验指导制备。硝酸盐还原剂、氧化酶试剂、公司）、药敏纸片购自南阳市畜牧兽医站（上海市医学化验所试剂厂生产）1.1.4 试验动物小白鼠（购于南阳畜牧兽医站）和各日龄健康鸡（购自唐河县分散养殖场）1.2 试验方法对送检的35只病死鸡进行了病理剖检及大体病变的观察。样品l在各种培养基上划线分离（置37弋培养24h）l菌落形成llll挑取菌落染色镜检 纯培养 培养特性检查染色镜检生化试验 致病力测定 药敏试验采集鸡场病死鸡各一只，无菌取心脏和肝脏。注射器
9、自心脏采血 1ml 用于 细菌分离培养，用灭菌后的外科手术刀片烧烙脏被膜后，再用接种环刺入肝实质 取肝样做分离培养。以无菌操作的方法，将采取的病料，分别接种在普通琼脂平板、麦康凯琼脂、 伊红美兰琼脂，37弋恒温培养24h，然后观察。挑取表面光滑、边缘整齐、灰 白色半透明的单个微隆起小菌落划线接种于肉汤中在37弋恒温培养24h5b挑取麦康凯琼脂平板上培养 2O h 的新鲜菌落,光滑、砖红色的单个菌落涂 片将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液,染1min ,水洗;滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗；滴加95%乙醇脱色约15 - 30s,直至染色液被洗掉，不要过 分脱色，水洗；滴加番红染液，复染1mi
10、n,水洗、待干、镜检。结果：革兰氏 阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色6，观察记录菌体形态和染色特征。发酵试验取可疑菌分别接种葡萄糖乳糖麦芽糖甘露醇和蔗糖发 酵管N3HR培养2Bgdn观察结果kmrb甲基红n试和vp（乙酰甲基甲醇试试取可疑菌接种葡 萄糖蛋白胨水培养分别加入05和5P指示剂，观察结果 IBB试验取蛋白胨水培养管先加少量乙醚，塞紧棉塞振摇试管!使蛋白醚充胨水培养液与乙醚充分混匀，放于试管架上静置片刻，待乙醚漂浮于液面上层时， 沿管壁滴加吲哚试剂23滴，观察其颜色变化刀。动物试验将分离菌接种于营养肉汤，于37弋恒温培养箱中培养24h。取健 康小白鼠6只分为人B两组，A组3只腹腔接种营
11、养肉汤菌液每只02mL ；B组3只，腹腔接种等量的灭菌生理盐水作对照组，分别隔离饲养观察。取6只7日龄雏鸡，健康，也随机分为C、D两组，与小白鼠同样的方法，C 组皮下接种营养肉汤菌液，每只 02mL；D 组接种等量的灭菌生理盐水，隔 离饲养。药敏纸片购于南阳市唐河县畜牧兽医站（上海市医学化验所试剂厂生产），选取不同地区的分离株6株进行药敏试验。在无菌条件下将培养24h的肉汤培养 物，用灭菌生理盐水作 10 倍稀释，取 02mL 滴加在普通琼脂平板培养基上， 用灭菌棒涂匀，平板室温下干燥35min，用无菌镊子将卡那素、新霉素 庆大霉素、呋喃妥因、 四环素、链霉素6 种药物的含药纸片紧贴于琼脂表面
12、， 各纸片中心相距大于20mm，纸片距平板内缘大于15mm8;置35弋恒温箱 内1618h后，观察结果。2 结果与分析2.1 病理剖检剖检时可闻到特殊臭味，见病鸡胸腔、腹腔内有大量黄色干酪样渗出物腹腔内大块黄色块状渗出物；肝脏肿大，表面瘀血，有散在的白色小坏死灶；纤维性心包炎，心包浑浊增厚，心包腔内充满大量淡黄色液体，心包膜及心外膜上有白 色纤维蛋白附着，严重者可见心包膜与心外膜粘连；肺脏瘀血，表面的纤维性渗 出物明显；肠黏膜弥漫性出血，整个肠管呈紫红色；肾脏体积肿大，呈紫红色， 肾脏出血，水肿，质脆，一触即烂。2.2 大肠杆菌的分离培养麦康凯琼脂上形成红色.圆形隆起.光滑湿润.边缘整齐.直径
13、为1525 毫米的小菌落（见图 1）；在伊红美蓝琼脂上形成紫黑色、具有金属光泽的小菌落（见图 2）；在普通琼脂斜面上形成灰白色的菌落；在普通肉汤中呈现均匀浑浊，管底形成灰白色沉淀，并有粪臭味。1 麦康凯琼脂图2 伊红美蓝琼脂2.3 形态学观察经镜检可见到革兰氏阴性菌两端钝圆有长约1.5 3.O 微米的短小杆菌,偶有23个菌体相连，无芽抱。（见图3）2.4 生化鉴定3 镜检结果将分离到的菌株，经生化试验鉴定，分解葡萄糖、麦芽糖、甘露醇产酸产气，不分解蔗糖,MR试验呈阳性，VP试验为阴性，吲哚试验阳性硝酸盐试验阳性，枸橼酸盐试验阴性，硫化氰试验阴性。此结果符合大肠杆菌的特征，见表1。生化 试剂乳糖
14、葡萄甘露麦芽阿拉 伯糖山梨表1分离菌生化生结果生化 试剂Ml Uft 枸橼 酸盐VP试验靛基 质MR试验硫化 氢尿素 酶吲哚硝酸注：+表示阳性；一表示阴性；+表示阳性并产气阴2.5 致病性试验小白鼠试验结果：接种36h内A组小白鼠全部死亡，解剖可见肝脏肿大、 出血和灰白色坏死灶，脾脏瘀血肿胀等明显病理变化，从死亡小白鼠的肝、心、 脾等病料中均能回收到接种菌；B组小白鼠饲养1 周后全部存活,剖检无病理变 化。雏鸡试验结果：接种1周后，C组雏鸡全部死亡，取死鸡的肝、脾接种于普 通营养琼脂培养基上，经37弋恒温培养24小时后，有菌落生长，生化鉴定及 革兰氏染色表明：该菌与接种菌为同种细菌；D组雏鸡则正常。动物试验结果表明：此次分离出的细菌对雏鸡和小白鼠均有较强的致病性。2.6 药敏试验卡那霉素、新霉素、庆大霉素等药物为高度敏感；呋喃妥为中度敏感；链霉素不敏感；见表2。表2 耐药性实验结果统计药敏抑菌圈直径/mm纸片1号2号3号4号5号6号菌株菌株菌株菌株菌株菌株呋喃109111098妥因卡那222020172121霉素
