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1、本科毕业设计（论文）题目： 来源于巨大芽孢杆菌ALA2的 细胞色素P450 BM-3的蛋白质工程研究学院： 专业： 学号： 学生姓名： 指导教师： 职称： 年 月 日摘 要细胞色素P450酶系是广泛分布于动物、植物和微生物等不同生物体内的一类代谢酶系。来源于巨大芽孢杆菌（Bacillus. megaterium）的细胞色素P450 BM-3可以快速催化链长大约C12C18的饱和脂肪酸的单加氧酶活性，其中对C15和C16脂肪酸的活性最高。编码P450 BM-3的基因（CYP102）已被克隆并在大肠杆菌中得到表达，从大肠杆菌中表达的P450经纯化后与从巨大芽孢杆菌纯化的P450 BM-3有相同的功
2、能、免疫化学和电泳特征，其N-末端序列也一致。本实验采用来源于巨大芽孢杆菌ALA2的细胞色素P450 BM-3基因进行蛋白质工程设计，按此依据进行定点突变和重组表达，并和原始基因在大肠杆菌中表达情况进行对比。相比于野生型细胞色素P450 BM-3，F87L对吲哚显示了较高的活性，酶活提高约6.98 %，由此证明Phe87对反应选择性控制起着关键的作用，是影响该酶表达量和表达活力的主要因素。并为进一步探索体外合成的细胞色素P450 BM-3进行生物催化应用打下较好的基础。关键词：巨大芽孢杆菌，P450 BM-3，F87L，吲哚The study on protein engineering of
3、 the cytochrome P450 BM-3 from B. megateriummALA2AbstractCytochrome P450 is a kind of metabolic enzymes which are widely distributed in animals, plants and microorganisms. Cytochrome P450 BM-3 from B. megateriumm shows high monooxygenase activity for long chain saturated fatty acid(12-18 carbons), e
4、specially fatty acid with 15 and 16 carbons are the highest.P450 BM-3 encoding gene (CYP102) has been cloned and expressed in E. coli, the purified P450 expressed from E. coli has the same function, immunochemistry and electrophoresis characteristic with the purified P450 BM-3 from B. megateriumm, a
5、nd their N-terminal sequences are also consistent.The study usesd the cytochrome P450 BM-3 gene from B. megateriummALA2 for protein engineering design, according to which we conducted site-directed mutagenesis and recombination expression,and compared with the original gene expression in E. coli. F8
6、7L shows a litter higher activity towards indole than wild-type P450 BM-3, and the enzyme activity has increased by 6.98%, which proved that Phe87, playing a key role in the control of reaction selectivity, is the major factor influencing the enzyme expression and activity. The study also lay a good
7、 foundation to further exploration of cytochrome P450 BM-3 mutant for biocatalysis application.Keywords: Bacillus. Megaterium,P450 BM-3,F87L,indoleII 目 录摘 要IAbstractII前 言11 文献综述21.1 细胞色素P45021.1.1 细胞色素P450的酶系组成21.1.2 细胞色素P450的结构折叠21.1.3 细胞色素P450的底物结合与识别31.1.4 细胞色素P450的天然底物31.1.5 细胞色素P450的催化反应41.1.6
8、细胞色素P450基因的简化结构51.2 细胞色素P450 BM-361.2.1 细胞色素P450 BM-3的来源61.2.2 细胞色素P450 BM-3的结构61.2.3 细胞色素P450 BM-3的表达与诱导71.2.4 细胞色素P450 BM-3的催化反应71.2.5 细胞色素P450 BM-3的基因重组研究与应用72 细胞色素P450 BM-3基因克隆及其在大肠杆菌中的表达102.1 实验材料102.1.1 主要仪器102.1.2 菌株与质粒112.1.3 培养基与储液112.1.4 主要试剂132.2 实验方法142.2.1 突变位点的选择142.2.2 引物设计142.2.3 反向P
9、CR反应152.2.4 PCR产物纯化162.2.5 琼脂糖凝胶电泳172.2.6 目的片段和载体割胶回收纯化172.2.7 DNA浓缩182.2.8 DNA磷酸化182.2.9 质粒的自身环化192.2.10 大肠杆菌感受态细胞的制备192.2.11 重组质粒电击转化202.2.12 质粒提取212.2.13 重组细胞色素P450 BM-3酶活检测212.2.14 细胞色素P450 BM-3酶活测定222.2.15 纯度鉴定方法223 实验结果与讨论253.1 定点突变重组子的构建253.2 突变基因测序结果与分析253.3 重组质粒验证263.4 粗酶液SDS-PAGE分析263.5 酶活
10、的初步测定273.6 氨基酸突变结果讨论29结 论30展 望31致 谢32参考文献33ii前 言20世纪70年代中期从巨大芽孢杆菌（B. megaterium）中发现了具有脂肪酸羟基化活性的P450，已从芽孢杆菌中将P450 BM-3纯化到同质，可作用于烷烃、脂肪酸、萜类、甾族化合物的惰性碳氢键，发生具有较高的区域选择性和立体选择性单加氧反应。因此，细胞色素P450被认为是精细化工合成的潜在催化剂。然而，它们本质上不是很活跃，表现出较差的稳定性，需要如铁氧化还原蛋白，黄素单核苷酸还原酶和NAD(P)H作为电子转移的相关因子。细菌细胞色素P450相对比较稳定，具有高活性，并且运用重组表达系统往往
11、可以大量准备。来源于巨大芽孢杆菌的细胞色素P450 BM-3是一种经研究最好的细菌的P450，P450 BM-3分子质量很大，119 kDa，仅需底物和NADPH就有全活性。1 mol纯化的P450 BM-3包含1 mol FAD、FMN和血红素，可以催化细胞色素C以及其他人工电子受体。相比于其他P450s其性能更接近应用需求。但很多的研究表明，该酶有十分明确的底物特异性。为了获得对除了以长链不饱和脂肪酸为底物的反应活性，细胞色素P450 BM-3的蛋白质工程被广泛地研究。目前定向进化技术在改变酶功能特性和构建具有新的功能特性的酶中显示出巨大的潜力，比如P450 BM-3(A74G,F87V,
12、L188Q)突变体能够催化吲哚生成靛蓝，这是野生型P450 BM-3所不具有的催化功能。大肠杆菌（E.coli）具有表达水平高，繁殖周期短，容易操作，有许多菌株突变体和含强启动子的载体可供使用等优点，因此常用于P450的表达。本研究运用定点突变手段对细胞色素P450 BM-3进行改造，并和原始基因在大肠杆菌中表达情况进行对比，找出影响该酶表达量和表达活力的主要因素，为进一步探索细胞色素P450 BM-3进行体外生物催化应用打下较好的基础。本研究在药物开发，生物降解和生物催化过程具有十分重要的意义，加氧酶的应用也具有广泛的市场前景。1 文献综述1.1 细胞色素P450细胞色素P450，是一类与重
13、金属结合的配体，形成的酶在生物细胞通过可逆性的变化而进行电子传递。因它与一氧化碳结合后，在450 nm处有吸收峰，故有此名1。细胞色素P450广泛分布在脊椎动物或无脊椎动物（包括昆虫）、植物和微生物中。在生命过程中，内源物质的代谢与转化或外源化合物的活化与降解等都需要细胞色素P450酶系的催化与调控。由于该酶系的性质和功能及其在生命活动中它的作用，因此在药理学和毒理学的研究中它一直是引人关注的重要研究领域。 1.1.1 细胞色素P450的酶系组成细胞色素P450是广泛分布于动物、植物和微生物等不同生物体内的一类代谢酶系，作为功能单位，该酶系由多种组分组分组成。目前已知的细胞色素P450酶系的主
14、要组分包括两种细胞色素（细胞色素P450和细胞色素b5）、两种黄素蛋白（即NADPH-细胞色素P450还原酶和NADH-细胞色素b5还原酶）以及磷脂等，其中细胞色素P450和细胞色素P450还原酶最为重要。1.1.2 细胞色素P450的结构折叠通常P450有4个-折叠，大约是13个-螺旋，其中5是可变的。P450保守的结构核心由螺旋束D、E、I、L及螺旋J、K组成。螺旋I包含高度保守的苏氨酸。N-端有酸性残基，位于活性中心吡咯环B的上方。螺旋K含完全保守的E-X-X-R，可能参与稳定核心结构，位于血红素近侧（即假定的氧化还原个搭档结合侧）。螺旋L构成血红素结合区的一个部分。有两套结构保守的-折
15、叠，一为-折叠1，包含5个股（strands）；另一为-折叠2，包括两个股；这些折叠有助于形成疏水性的底物进入通道1。所有P450具有结构保守的共有序列（consensus sequence），位于血红素的近表面包含完全保守的半胱氨酸（Cys），它是血红素铁的第五个配体，也是CO-结合蛋白在450 nm有特征Soret吸收的原因。在蛋白质的近表面还有一卷曲成为曲（meander），其结构高度保守，以前称为芳香区（aromatic region）。因此，变异较大的结构元件是螺旋A、B、B、F、G、H、K、-折叠3和4以及环（loop）。这些可变区包含与底物特异性有关的部分。图1.1 细胞色素P450的结构图Figure1.1 T
