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1、文献翻译用反极性间接吸光检测毛细管电泳法对草摘要甘膦及其在植物体中代谢产物的检测本篇报道是关于一种简单的毛细管电泳方法同时测定草甘膦及其在植物体的代谢产物（即氨甲基膦酸，乙醛酸，色氨酸和甲醛）的。PH=7.5的 背景电解质， 10% 乙腈， 7.5 mmoL 邻苯二甲酸，含 0.75 mmoL 烷基三甲基 溴化铵作为电渗流改性剂，加 20 KV 和在 220 nm 下吸光光度法检测是最佳的 化学和仪器数。该方法，研制时间20 min,显示线性校准范围内的5-500 mg/mL （所有目标组分）与相关系数之间的0.999和0.998。它已被验证的应 用样本黑麦草品种。该电注入模式阻碍了大多数干扰
2、进入毛细管，从而提供 一个干净的电泳和不必要的长时间的样品制备步骤。关键词：氨甲基膦酸, 甲醛, 乙醛酸, 草甘膦, 色氨酸.1 简介草甘膦（甘氨酸）N-（膦酰基甲基）甘氨酸是一种控制长草和阔叶杂草的苗 后除草剂。应用后，甘氨酸是通过叶子吸收并改变植物的组织位置，在产生芳香 族氨基酸如苯丙氨酸蛋白质合成和其他中学植物产品1.的莽草酸合成途径中，甘 氨酸抑制 5- 烯醇丙酮酸-3-磷酸合成酶（兴奋性突触后电位合酶）的产生。 1974 年，甘氨酸是第一个在孟山都公司的名义下商业化，由于其有效性和相对哺乳动 物较低毒性成为一个世界最广泛使用的除草剂。近年来，在农场出现植物抗甘氨 酸，造成百万的损失。
3、目前公认的甘氨酸代谢退化的机理可以解释植物对这种杀虫剂的抵抗，但同 时测定草甘膦及其在植物体的代谢产物即氨甲基膦酸（AMPA）,乙醛酸（GLYO）, 色氨酸（SAR）和甲醛（FA）在残留水平在复杂的基质阻碍证实这一机制A5甘氨酸及其代谢产物的特点是在水中的溶解度相对高，不溶于有机溶剂，高 极性和低挥发性。为了减少它们的极性和提高挥发性，在气相色谱分析之前强制 衍生6，7。另一方面，由于在这种分析物中缺乏荧光团或发色团，高效液相色谱 法或吸收毛细管电泳法或荧光检测器的使用是有限的。因此，无论是衍生前或后， 对分析物吸收或荧光检测器的检测是强制性的8,9。为了避免这种繁琐和通常费 时的步骤，间接紫
4、外可见吸收检测10，间接荧光检测11，电喷雾电离质谱12,13， 火焰离子化检测14，电化学发光15和电凝结核光散射检测已用于检测这些分析 物。在这个研究中，由于它的普遍性，间接的紫外可见吸收，广泛应用的毛细管 电泳法被选用为检测的方法。间接检测的主要问题是大多数缺乏灵敏性；与此同 时，其他检测方式需要更昂贵和复杂的设备。在文献中没有任何同时测定甘氨酸及其代谢物的方法；因此，考虑到此除草 剂的两种已知的代谢途径，这种方法将是非常有用的。在所有化合物包括甘氨酸 的代谢的测量步骤中将提供一个可靠的方法去研究甘氨酸在植物中代谢途径，从 而，了解一种给定植物对这一除草剂的抵抗。本研究提出的目的是发展一
5、个简单，快速和低成本的方法来检测甘氨酸及其 代谢产物，进行在植物体中它的特性抵抗这种除草剂的全面研究。2 材料与方法应用甘氨酸的植物于一个封闭的配有一个扁平喷射喷雾头80.02梯杰特的内 喷雾室（惠顿，美国）。自动调温带犁的离心机（富勒顿，美国），提供一个20 号转子；Bunsen （西班牙）的磁力搅拌器，一个塞尔克塔超声波浴（巴塞罗纳， 西班牙），配有温度控制-功率50瓦特的发电机；瓷砂浆，配有Pobel （马德里， 西班牙）的研杵，孔径45 m *13 mm内径的尼龙过滤器（Carrigtwohill,爱尔兰）； 和圆底无菌聚苯乙烯管（Deltalab,西班牙）用于样品制备。一个三维安捷伦
6、 G1600A的毛细管电泳仪，配有一个二极管阵列检测器（量程190 -00 nm）；毛细 管（有效长度80厘米）88.5 cm*50 mm内径*375 mm外径和恒温的塞贝克效应单 元，用于分离和定量组分。用安捷伦化学工作站软件控制该仪器设备和数据采集 和处理。2.2 试剂丙酮，氢氧化钠，乙腈，甲醛，盐酸和邻苯二甲酸钾，溴化十六烷基三甲铵 （Buchs, 瑞士），色氨酸和乙醛酸（圣路易斯，美国），氨甲基膦酸（贝尔丰特， 美国）和甘氨酸。来自孟山都公司（圣路易斯，美国）的商业甘氨酸36%用于植 物治疗。储备标准溶液的制备：每个样品0.1 g溶解于100 mL水，10 mmoL邻苯二 甲酸钾，0.
7、5 mmoL溴化十六烷基三甲铵和10%的乙腈（PH=7.5）；使用从微孔 Milli-Q水净化系统完全净化的去离子水。本储备的标准是在20C可以储存六个 月没有降解。每日在背景电解质下通过稀释适当体积的储备溶液即为标准溶液。 液氮（普莱克斯，西班牙）是用于样品制备。2.3 样品收集不同区域的5中不同的杂草生物幼苗（花黑麦草）以湿滤纸为基质在培 养皿中发芽。将这些幼苗移植到塑料花盆（每个花盆中三种植物，泥炭土：粘土 =1： 2作为底物）中。当植物平均六个叶片时， 90%的植物加入商业甘氨酸，其 余的用来作为空白。在200 KP下，在封闭喷射室校准0.5 m高度以上向目标表面 以相对容积200升/
8、公顷喷洒。在应用甘氨酸0和96小时后，切断所有处理和空白 的植物，在-40 C下用液体氮冷冻储存直到使用。2.4 实验方法2.4.1 样品制备过程该程序分为2步：从固体基质中提取目标分析物和提取物的富集-清理。提取之前，冷冻样品用20mL水洗涤三次清除叶面上的甘氨酸和的残留的土 壤。总的来说，1.5 g样品放置在瓷研钵中，使用20 mL氮闪存冻结的液体。然后, 样品用瓷杵磨5分钟成粉末，将粉末转移到一个塑料烧杯中，用8 mL1 : 1水-丙酮 提取三次，每一次均使用磁搅拌搅拌10分钟，超声5分钟，在41 C和1000转下离 心15分钟。在富集-清除步骤，获得的三份8 mL上清萃取剂在氮流量下汇
9、集蒸发至干。 在毛细管电泳法分析前，提取物用2 ml背景电解质重溶，并用尼龙过滤网过滤。2.4.2个体分离-紫外线吸收毛细管电泳法检测过滤后的提取物在-10 k V，背景电解质（10 mmoL邻苯二甲酸钾，0.5 mmoL 溴化十六烷基三甲铵和10%的乙腈（PH=7.5）下注射5s。分析电压为-20 k V， 波长为220nm下检测所有分析物。为保持毛细管为最佳工作条件，每次有序的用 水洗（2 min），0.1 moL氢氧化钠（2 min）洗涤，1 min的等待和背景电解质洗（10 min）后，它的表面再生。此外，该毛细管每天连续水洗（1 min），0.1 moL 氢氧化钠洗（10 min），
10、 5 min等待和水洗1 min。3 结果与讨论最佳顺序包括2步：第一步，集中在用毛细管电泳法-DAD最好的分离测定化 合物，第二步，目标化合物的提取和清理-富集。最佳的电泳分离是从标准和提 取物包括没有喷洒甘氨酸的空白样品中进行。要考虑到提取物可能有共同提取干 扰存在的目标分析物被掺入。在初步实验中，建立分析物的检测最佳波长，毛细 管长度和在动力和电动注射之间的最好的形态。31最佳的个体分离-紫外线吸收毛细管电泳检测进行了涉及电泳分离的主要变量的影响包括在最短的时间内取得最好的分 离组分的研究。研究的变量有毛细管温度，分析电压，注射电压，注射时间和那 些与背景电解质（即PH，邻二苯酸氢钾浓度
11、，溴化十六烷基三甲铵浓度，和有 机调节剂的百分比）有关。用于这一步最优化的反应变量是半峰宽，峰高和用表 示（tm2-tm1）/tm1的分辨率，幕是时间的迁移。为了在最短的时间达到最佳的分辨 率最高灵敏度第一个变量应该是两者中尽可能的微弱和最高。邻苯二甲酸氢钾的双重作用PH的固定，并作为发色团。背景电解质的PH高 到足以确保所有组分为带电（满足PH=7.5）和10 mmoL邻苯二甲酸氢钾以提供最 高灵敏度；同时在背景电解质中0.5 mmoL溴化十六烷基三甲铵和背景电解质足 够满足反向电渗流的目标。为了两峰间有较好的分辨率，10%的乙腈（PH=7.5） 被用来作为有机背景电解质调节剂。也详尽的研究
12、了毛细管温度。尽管最佳分辨 率在30C,但其使用阻碍目标分析物的降解；因此，20C被选为提供了最好的分 辨率且不降解的温度。在短时间内，-20 k V的电压提供了分析物和样品基质之 间的最佳分辨率。注射模式是减少样品基质中一个关键干扰变量。众所周知毛细管电泳法使用 者的电注射模式减少这些干扰使带电的化合物优先进入毛细管的。因此，这种注 射模式被选定为随后的实验。 2种注射变数（即电压和时间）进行了优化，获得 最好的灵敏度和最低干扰的峰分辨率，其值分别被固定在-10千伏和5秒。较高的 注射电压和更长的注射时间使峰宽增加和来自基质干扰都不利电泳图。经过优化步骤，注射重复性和再现性的研究即根据面积和
13、保留时间求得标准 和提取溶液产生标准偏差低于6%；因此，使用一个内标准是不必要的。最佳工 作条件下，400 mg/mL标准溶液包括所有分析物，在同一浓度标准的溶液下的一 个空白提取和一个空白添加组分提取物方案如图1所示。此图显示目标分析物无 背景干扰的基线分离不到18分钟就实现。甘氨酸和氨甲基膦酸基线分离小于11 分钟。这一次是在文献中发现，类似用高效液相色谱法或毛细管电泳法检测植物 中的甘氨酸和氨甲基膦酸17,18。这是值得的强调个体的分离和测定的方法，迄今 提出允许使用高效液，相色谱 2023，气相色谱2426或毛细管电泳法15，27-29鉴定 和定量唯一的甘氨酸和氨甲基膦酸（其中大部分是
14、水），而不是那些其他代谢产 物例如乙醛酸，色氨酸，甲醛。此方法报告，在一个单一的电泳步骤中，农药及 化合物的测定产生两种已知代谢途径。该方法避免了耗时的衍生化 6，8，9 可降解 组分和使用更复杂的检测系统例如质谱检测器 12。3.2样品的制备：最佳的提取-富集-清理程序3.2.1 提取程序提取-富集-一清理程序的最优化检测即为最佳分离检测条件，目的是在 最短的时间内实现从背景电解质中移除目标化合物的最大量。显然，真正的样本 用于优化样品制备，分为2步：分析物的提取和提取物的富集-清理。在提取步骤进行了优化的变量是：提取剂，提取时间（常规和超声波协助）-和完全移除提取剂的数量。反映变量用于优化
15、这一步的目标化合物的峰面积。这个变量应更可能以实现在最短的时间内最大限度没有降解效率的提取。图1： A:标准的电泳图；B:空白样本图；C:加有目标分析物的空白样本图；D：添加的目标分析重氨甲基膦酸表1. 优化的提取步骤VariableTested rsOptimum valug(efficientv)Water-methanDl (%)0-100Water-scetori& 光)Q.1-10Q50CDmvgntial &xtraction min)1-3fl10UFt站sonic axtractiam (min1-305ComvefttiorisH- ultra so nit0-3010-5extrattiun min)Number of extrattiDii tycl&s1-103水-丙酮混合物比水甲醇的混合物提供了更好的提取效率。这一事实可以 解释，因为丙酮比甲醇具有较高的功率使蛋白质变性。达到1 : 1的比例；这是 为随后的实验选择最佳提取率。常规搅拌方法的动力学研究,目的是了解超声波照射的超声辅助是否缩短 提取时间和/或这类能源是否降解目标分析物。传统搅拌提取，超声协助提取这两种类型的使用的峰面积作为反映变量进 行比较。图2可以看出，第2程序不提供极大的提取效率，这是通过常规的有序应用和超声波提取。t-MINrmwJ Sr0E+Q47f0C+C1I1.0
