目的基因的克隆转化及重组子筛选

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1、目的基因的克隆、转化及重组子筛选一实验目的：(1) 学习和掌握DNA片段胶回收的方法。(2) 学习DNA连接的有关技术。(3) 掌握用CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。(5) 掌握质粒提取的基本方法。(6) 学习和掌握限制性内切酶的使用方法。二.实验原理：(1) cDNA的TA克隆:Taq酶能够在PCR产物的3末端加上一个非模板依赖的A,而T载体是 一种带有3 T突出端的载体，在连接酶作用下，通过粘性末端连接，把PCR产物插入到质 粒载体的多克隆位点，称为T-A克隆。可用于PCR产物的克隆和测序。(2) 感受态细胞制备原理：细菌处于容易吸收

2、外源DNA的状态叫感受态，细菌处于0C, CaCl2 的低渗溶液中，细胞膨胀，细胞壁通透性增强，在冷热变化刺激下细胞膜表面产生裂隙，使 外源DNA进入。(3) 蓝白斑筛选:载体带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码a - 互补肽；宿主细胞编码C端部分序列。诱导物IPTG和乳糖的结构相似，可以与乳糖操纵元 的阻遏蛋白结合，从而解除阻遏蛋白的作用，使载体得以合成a -互补肽，与宿主细胞编码 的C端部分结合形成B -半乳糖苷酶，而X-Gal是B -半乳糖苷酶的显色底物，在B -半乳糖苷 酶的催化下会产生蓝色产物。可用于重组克隆的筛选，重组克隆无法产生a -互补肽，因而 无法

3、使X-Gal显色，培养基上表现为白色菌落。三实验材料：大肠杆菌DH5a、LB培养基0.1mol/LCaCDNA割胶回收试剂盒,试管，Amp/IPTG/X-Gal， 三角玻璃棒，玻璃珠，牙签，1卩lpMD19-T Vector、质粒提取试剂盒。四实验步骤、现象、结果及分析：(1)cDNA电泳及胶回收1.提取总RNA,反转录cDNA,用设计好的引物扩增出不同的目的片段。取目的基因产 物进行琼脂糖电泳，紫外灯下切胶。2.把所割胶放入1.5 ml EP管，称重如下表一。表一：cDNA琼脂糖凝胶重量空管2管3管重量(g)0.90451.22801.2961净重(g)0.32350.39163. 按 lg

4、/lml 的量，大致各加入400卩1 Binding Buffer，65C水浴 7min；(每隔 23 min, 摇一下)；4. 把溶液转移至spin-column, 10000g离心1 min，倒出套管内残液；5. 在柱子中加入300卩l Binding buffer, 10000g离心lmin,倒出套管内残液；6. 在柱子中加入700ul的SPW溶液，放置3min, 10000g离心lmin，去残液； 7.10000g离心1min (去乙醇)；8.把柱子放入干净的1.5ml EP管。加Elution Buffer 20卩l。室温放置1min, 10000g离 心 1min。9检测DNA的纯

5、度和浓度，如下表二所示。选取质量好的2号组进行接下来的连接转 化。表二：cDNA吸光度测定2组3组A260/A2801.8641.867浓度（ng/pl）146.718128.242（2）感受态细胞制备1. 从新鲜培养的LB平板上挑单个DH5a大菌落接种到3mlLB培养液中，37 C居0烈振 荡培养过夜（教师准备）。2. 取过夜培养的大肠杆菌DH5a按1：50取1ml菌液接种到50ml LB培养基中，37 C 振荡培养，1hr后用分光光度计测其OD值为0.182, 1.5 hr后再测其OD值，为0.304,到 达其对数生长期（细菌对数生长期OD 600为0.2-0.4）。3. 分别取1ml菌液

6、至1.5 ml离心管中标记为1号、2号、3 号,培养物冰上放置10 min， 5000 r/min,离心2 min ,用枪头吸取废液，弃去，收集底部菌体。4分别加入500口预冷的0.1 mol/L CaCl2，用枪头吹散，使菌体悬浮于预冷的CaCl2 中，冰上放置10分钟。5.离心机5000r/min,离心2min,用枪头吸取弃上清，分别加入100卩l预冷的0.1 mol/L CaCl2，小心用枪头吹散，0C保存3hr。（3）连接和转化组别实验组正对照组负对照组操作连接:从2号胶回收DNA EP管中取4pl, 加入 1卩l pMD19-T Vector、5pl Solution I组成10卩l

7、连接反应体系，在16C下进 行连接反应；转化:30min后加入1号100卩l感受态细 胞EP管中，以手指轻轻触碰混匀，冰中 放置30min进行转化，接着42 C热激 45sec，再在冰中放置1min,最后加入 390卩l LB液体培养基于37 C振荡培养 50min。取 1卩l（5ng/pl） 质粒加入2号 100卩l感受态细 胞EP管中。无需取任何物 质加入3号100卩l 感受态细胞EP管 中。样品组-100卩l：从上述500卩l体 系中取100卩l加入 LB/Amp/IPTG/X-G al平板，最后加入 玻璃珠，摇动混匀， 于37 C倒置、过夜培养。样品组-200卩l：从上述500卩l体

8、系中取200卩l加入 LB/Amp/IPTG/X-G al平板，最后加入 玻璃珠，摇动混匀， 于37 C倒置、过夜培养。从上述101卩l体 系中取50卩l加入 LB/Amp/IPTG/X- Gal 平板，最后加 入玻璃珠，摇动混 匀，于37C倒置、 过夜培养。从上述100卩l体 系中取100卩l加入 LB/Amp/IPTG/X- Gal 平板，最后加 入玻璃珠，摇动混 匀，于37C倒置、 过夜培养。注：LB/Amp/IPTG/X-Gal 平板配制：取固体LB培养基于微波炉中融化，在超净工作台中冷却至55C左右，加入80卩l氨苄 青霉素，混匀，倒入四个已消毒并做好标记的平板，分别是：样品组100

9、山、样品组200口、正对照组、负对照组，然后在遮光条件下分别用三角玻璃棒涂布X-Gal 40卩1和IPTG 10卩1。II10月25号(1)取出过夜培养的4个平板，拍照并计数。结果如下图所示：g图一：样品组-100卩1图三：正对照组图四：负对照组从上述四图可以看出，图三正对照组出现大面积蓝色菌落，证明空载质粒转化成功，平 板边缘菌落呈白色，是因为LB/Amp/IPTG/X-Gal平板配制时是使用三角玻璃棒涂布X-Gal, 导致边缘不含或少含X-Gal。图四负对照组无菌落出现，因培养基中含氨苄青霉素，而感受 态细胞无抗性，因而不能生存。图一样品组-100卩1出现白色和蓝色菌落，证明重组质粒转化

10、成功，图二样品组-200卩1也出现白色和蓝色菌落，但密度比图一高。白色菌落密度偏高（与其他组相比）的原因：5ng / p! x1 ypx10-9g / ng空载质粒的摩尔数=2692x660g/mol=3X10-15no14p! x146.718ng/p! x10-9 g / ng460x660g / mol插入DNA片段的摩尔数=1.933 X 10-i2mo1空载质粒的摩尔数：插入DNA片段的摩尔数心1:1000，该比值远小于1:2到1:10的范 围，待插入DNA片段过多，当时未稀释待插入DNA，直接进行了转化实验，导致重组白 色菌落密度偏大。对图三正对照组蓝色菌落进行计数，将平板划均分为

11、8块扇形，计数2块扇形部分内菌 落数分别为850、650，平均为750，总计6000，空载质粒转化效率计算如下：1卩15ng/p1即5ng的质粒加入2号100卩1感受态细胞 EP管中，取50卩1加入 LB/Amp/IPTG/X-Gal平板，最后加入玻璃珠，摇动混匀涂布平板，第二天记录蓝色菌落共 计 6000，此时转化效率=6000cfu/ 50 5ng=2.4X 103cfu/ng=2.4X 106cfu/yg 质粒100 1(2) 在超净工作台中，从样品组-100卩1中用牙签挑取白色阳性菌落接种于400卩1 LB-amp培 养基中，挑选4个菌落，分别接种于1号、2号、3号、4号试管中，于37

12、C振荡摇菌5hr。(3) 配制10卩1反应体系，进行PCR。10卩1反应体系如下：菌液DNA2卩1引物1 (10卩M)0.4 卩1引物2 (10卩M)0.4 卩12 XPCR Reaction Mix5卩1Taq 聚合酶（2.5 U/pl）0.2 卩1超纯水2卩1每组50卩1，从老师处领取后，自行分装8卩1/管，分别 EP管并从中取由于全班共配置100个反应体系，标号1、2、3、4,再对应上午振荡培养的1号、2号、3号、4号菌液培养 出2卩1作模板加入，后进行PCR反应。PCR反应条件如下：94 C变性3 min；94 C 30 sec, 60C 30 sec, 72 C 1 min，35 个

13、循环；72 C 5 min。(4) 电泳:桌面薄膜依次点上marker及1、2、3、4号PCR产物各4卩1,再分别加入1卩1 SYBR Gold，充分混匀，于1%琼脂糖凝胶中点样电泳。(5) 电泳完毕，取出凝胶，在紫外灯下观察染色后的电泳胶板，于凝胶成像系统中拍照并 保存之，电泳照片如下图五所示：Marker 111d2 :E图五：菌落PCR产物电泳示意图由上图可以看出，1、2、3、4号重组白色菌落PCR产物条带均在600bp左右，证明转 化成功。（6）随机从1号、2号、3号、4号菌液培养EP管中选取1号、2号，将菌液倒入1号、2 号3ml LB-amp培养管中，37C摇床过夜培养。III10

14、 月 26 号（1）质粒提取：1.取出过夜培养15hr的1号、2号试管，分别从中取1.5ml的菌液加入1号、2号EP 管，于室温下10，000 xg离心1min以沉淀菌种，由于菌液超过3ml，本实验步骤重复2次。2倒出培养基，往沉淀中加入250卩1 Solution 1/ RNaseA混和液，漩涡振荡使细胞完全 悬浮。3. 往重悬混和液中加入250 pl Solution II,轻轻颠倒混匀7次。避免剧烈混和裂解液， 否则会使染色体DNA断裂而使得到的质粒纯度降低。4. 往上述混和液中加入350 pl Solution III，温和地上下颠倒离心管数次混匀，直至形 成白色絮狀沉淀。室温下，13

15、, 000 x g离心10min.。（提高离心速度有利于沉淀贴壁更 加紧密）5. 取两干净的HiBind Mini Columns （I）各装在一个2 ml收集试管上。小心转移 上清液至柱內，室温下10, 000 x g离心1 min ,使裂解液完全流过柱子。弃去收集管中 的过滤液。6. 把柱子套在5所用的收集管上，加入500 pl Buffer HB到柱子中，室温下10, 000 x g离心1min洗涤柱子，除去残余的蛋白质。7. 弃去收集管中的滤液，加入700 pl DNA Wash Buffer （用无水乙醇稀释）至柱子，室 温10, 000 x g离心1 min，弃去洗涤液。再用 700 pl DNA Wash Buffer洗涤一次。8. 室温下10, 000 x g离心空柱2min以甩干柱子基质（除去乙醇）。9. 把柱子置于一干净的1.5ml离心管上，加入30 pl无菌去离子水到柱子基质上，室 温下静置2min。10, 000 x g离心2 min以洗脱出DNA。10. 检测质粒D