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1、热休克蛋白、蛋白水解酶和磷酸酶在大鼠肝再生中的含量和活性变化徐存拴 夏民 卢爱灵 李效阳 李永辉 赵绪永 胡轶红摘要：本文以2/3肝切除(partial hepatectomy, PH)大鼠为模型，探讨了 PH 后酸性和碱性磷酸酶(acid and alkaline phosphatases, ACP 和 AKP)、 构成性热休克蛋白70/诱导性热休克蛋白68(HSC70/HSP68)、酸性和中性 蛋白水解酶在肝再生期间(0144h)的动态变化。结果显示，在肝切除后 的肝再生期间：(l)ACP和AKP均出现两个活性高峰(4和48 h、16和96 h),在每个活性高峰之后，ACP和AKP活性均有
2、显著下降； (2)HSC70/HSP68在16和96 h时出现两个含量高峰，第二个高峰后的最 低点(接近于对照)比第一个高峰后的最低点低许多； (3)在2/3肝切除后 26 h时，诱导出一个90 kD的中性蛋白水解酶；36 h时，诱导出一个 27 kD的酸性蛋白水解酶。结果提示，ACP和90 kD中性蛋白水解酶可能 参与激活G期肝细胞进入G期；AKP和HSC70/HSP68可能主要在DNA合成、01细胞代谢和增殖方面起作用；27 kD酸性蛋白水解酶可能在肝细胞再分化 和肝组织重建中有一定作用。关键词：肝再生； 构成性热休蛋白 70/诱导性热休克蛋白 68； 蛋白水解 酶； 碱性磷酸酶； 酸性磷
3、酸酶； 酶的原位复性电泳学科分类号： Q954.61； Q593CHANGES IN THE CONTENT AND ACTIVITY OFHSC70/HSP68, PROTEINASES AND PHOSPHATASESDURING LIVER REGENERATION*XU CUN-SHUAN，XIA MIN，LU AI-LING，LI XIAO-YANG，LI YONG-HUI， ZHAO XU-YONG， HU YI-HONG(CollegeofLifeScience，HenanNormalUniversity，Xinxiang453002)ABSTRACT ： Th i s arti
4、cle reports changes in acid and alkaline phosphatases (ACP and AKP)， constitutive heat shock protein 70/inducedheatshockprotein68(HSC70/HSP68)andacidandneutral proteinases during liver regeneration (0144 h) after 2/3 hepatectomy (partial hepatectomy， PH). Both ACP and AKP had two active peaks at 4 a
5、nd 48 h， 16 and 96 h， respectively， which were followed by significant decrease. The content of HSC70/HSP68 also showedtwopeaks(16and96h)，ofwhichthecontentafterthesecond peakdecreasedmoreobviouslythanafterthefirstpeak.Moreover a 90 kD neutral proteinase was induced at the time from 2 to 6 h anda27kD
6、acidproteinasewasinducedat36h.Theresultssuggest that the ACP and the 90 kD neutral proteinase may participate in activating hepatocytes from G-phase into G-phase， and AKP andO1HSC70/HSP68 may play a role mainly in DNA synthesis, cellular metabolism and proliferation. Furthermore 27 kD acid proteinas
7、e may be involved in re-differentiation of hepatocytes and reconstruction of liver tissue.Key words: liver regeneration; constitutive heat shock protein 70/induced heat shock protein 68 (HSC70/HSP68); proteinases; acid phosphatase (ACP); alkaline phosphatase (AKP); non-denatured electrophoresis近些年,
8、肝再生方面的研究较多地集中在与肝再生有关因子的分离 与功能方面1。其实, 肝再生是一个涉及诸多因素非常复杂的过程, 在 肝再生过程中, 细胞除出现剧烈的形态和结构变化外, 生理、生化、 代 谢、 调控等方面也发生显著变化1,2。研究在这些变化中各种功能蛋白 (酶)的作用及机理, 有助于从分子水平揭示肝再生的本质3。蛋白水解对生命是必不可少的4, 在肝再生中, 原有组织的破坏、 受损和死亡细胞及细胞残体的消除、细胞功能变化等都离不开蛋白降解。 同时, 以蛋白质降解为主的不可逆性调节机制是细胞调控生命活动的重 要方式, 很多功能分子和调节成分的活化、 释放和消除也是通过蛋白降 解方式。 有作者报道
9、, 肝再生的启动是由于肝细胞释放的蛋白水解酶(胶 原酶和尿激酶)消化基质释放出肝细胞生长因子, 导致肝细胞去分化和增 殖1。 因此, 研究蛋白水解酶在肝再生中的变化和作用对了解肝再生的 分子过程有重要意义。现已知,以磷酸化和去磷酸化为主的可逆性调节机制是细胞调控生命 活动的重要方式5。其中,蛋白(酶)的磷酸化和去磷酸化是最重要和最广 泛的调控方式。在蛋白(酶)的去磷酸化过程中，酸性磷酸酶(acid phospha tases,ACP)和碱性磷酸酶(alkaline phospha tases,AKP)起着十 分重要的作用6。 因此， 弄清楚在肝再生 (一个涉及非常广泛的细胞代 谢和生理变化)
10、过程中磷酸酶的活性和作用, 必将有助于阐明肝再生的 分子机制和调节过程。热休克蛋白是近几年发现的一类有重要生物学功能的分子7, 它们 与细胞抗逆性建立、细胞内蛋白选择性降解8、细胞分化和去分化、细 胞增殖9、 组织器官再生、 胚胎发育、 肿瘤发生、 许多疾病的发生 等有密切关系I】。在已知的众多热休克蛋白中，HSP70家族的热休克蛋 白(包括大鼠的HSC70/HSP68)的作用最受人们关注m。因此，研究 HSC70/HSP68在肝再生中的作用，无论是对进一步了解热休克蛋白的功 能, 还是对揭示肝再生的分子机制都有重要意义。如果说肝大部分切除(PH)本身是启动肝再生的上游信号的话，那么 蛋白水解
11、酶、 酸性磷酸酶、 碱性磷酸酶、 热休克蛋白等则可能是在信 号指令下被激活的、 直接参与肝再生的功能分子。因此， 研究这些分子 在肝再生中的作用必将有助于了解肝再生的分子机制和调控过程， 本文 在这些方面进行了初步探讨。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 实验动物成年 SD 纯系大鼠, 由河南师范大学生命科学学院实验动物房提供，雌雄各半，体重200250 go1.1.2化学药品及试剂明胶（Sigma）、丙烯酰胺（USB）、甲叉双丙烯酰胺（Fluka）、过硫酸铵（Bio-Rad）、四甲基乙二胺（Bio-Rad）、 SDS（Gibco）、Tris-base（Gibco）、硝酸纤维素膜（Gibco
12、）、标准分子量 蛋白（上海东风生物技术有限公司）、 Tween 20（Fluka）、 考马斯亮蓝 R250（Fluka 进口分装）、HSC70/HSP68 的一级抗体（StressGen,产品编 号SPA-820,为鼠源性单克隆抗体，其制备抗原是人HSC72/HSP70,但亦 能与人、灵长目动物、兔、大鼠、牛HSP70/HSC70的N端1180氨 基酸区域特异结合）、 二级抗体（华美生物工程公司产品, 为山羊抗鼠 IgG-AP）, 过氧化物酶标记链霉卵白素（华美生物工程公司）, 本实验所用 的化学试剂至少为分析纯。1.2 方法1.2.1 样品制备将大鼠随机分组（每组至少3只）, 乙醚麻醉, 按
13、Higgins方法切除2/3肝（即切除肝的左外叶和左中叶，以下简称PH）,于 室温分别恢复2、 4、 6、 8、 10、 12、 16、 20、 24、 36、 48、 72、 96和 144 h后，脊椎脱臼处死，摘除眼球放血，（1）用于组织化学和免疫组织 化学分析时, 直接切取肝脏备用; （2） 用于制备匀浆液时, 用肝门静脉 灌注法将肝叶“洗白”后， 取下置于加有冰冷生理盐水的培养皿中剪碎， 在 4C、40 mmol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl、pH 7.5 的缓冲液（材料 湿重：缓冲液=1 ： 5）中匀浆，12000 g离心10 min,取上清液，分装， -85
14、C保存备用。1.2.2 ACP和AKP的组织化学将肝脏切成5mmX5mmX3mm小块，置液氮中速冻后，用冰冻切片机连续切片（厚8 p m）,用4C冷丙酮固定20 min,以Gomori铅法显示ACP,样品在保温液中保温（37C）40 min;以 Gomori钙-钻法显示AKP,样品保温（37C）1h;用不加0 甘油磷酸钠的 作用液做阴性对照。1.2.3 ACP和AKP活性的比色测定 取0.1 ml匀浆液，加入0.4 ml 缓冲液（测定 AKP 活性时，用 0.25 mol/L MgCl、0.2 mol/L Tris-HCl、2pH 7.5;测定 ACP 活性时，用 0.35 mol/L 柠檬酸
15、-NaOH-HCl, pH 5）和 0.4 ml 0.01 mol/L 0 甘油磷酸钠（空白对照加 0.4 ml 生理盐水）， 混匀， 37C保温30 min后，再加入0.1 ml 50%三氯乙酸（空白对照在加入匀浆 液时，同时加入0.1 ml 50%三氯乙酸），混匀，加2 ml三蒸水和3 ml 定磷试剂（6N HSO : H0 ： 2.5%钼酸铵：10%抗坏血酸=1 ： 2 ： 1 ： 1）混242匀后，于45C恒温水溶锅内保温25 min,取出待冷至室温后，于660 nm 处测定吸光值， 从标准曲线上求出磷含量。1.2.4一 HSC70/HSP68的免疫组织化学 取同一肝叶的同一部位，放入
16、 10%福尔马林中固定24 h， 常规石蜡连续切片（厚6 p m）， 间隔60 p m 取一片， 每只动物取4 片做免疫组化染色， 其中， 在1： 500稀释的一抗 中于4C过夜，在1 ： 200稀释的二抗中于37C保温1 h;在1 ： 200稀释 的SP中于37C保温1h,用过氧化物酶标记的链霉卵白素（SP）法染色（染 色过程中，用PBS代替一抗作阴性对照，未热休克肝作正常对照），用微 波炉（9298C）对切片进行10 min抗原修复，DAB系统显色，苏木精复 染12。1.2.5 蛋白质浓度测定、 聚丙烯酰胺凝胶电泳和酶的原位复性电泳 按 Neuhoff 等方法 13测定匀浆液的蛋白质浓度 ; 检测总蛋白种类时, 按 Laemmli等方法进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和显色；检测肝 脏的酸性、 中性和碱性蛋白水解酶活性时, 按徐存
