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1、北京六一仪器厂DYCZ-26C双向电泳系统检测报告技术部吴承疆QQ:50894034实验原理：双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白 质混合物的有力手段，已得到广泛应用。这项技术利用蛋白质的两种 特性，分两步将不同的蛋白质分离。第一向步骤为等电聚焦（IEF），即根据蛋白质的等电点（pl） 差异将蛋白质分离。第二向步骤为十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶 电泳（SDS-PAGE），即利用蛋白质的分子量（Mr,相对分子量）差异 将蛋白质分离。双向凝胶电泳结果中的每个斑点都对应着样本中的一 种蛋白。因此，可将上千种不同的蛋白质分离开来，并得到每种蛋白 质的等电点、表观分子量等信息。实验
2、方法：一.实验材料：1主要仪器和试剂（sigma,Ampholine购自GE）主要试剂超纯水（M让iQ）、尿素（Urea）、硫脲（Thiourea）、二硫苏糖醇（Dithiothreitol, DTT）、CHAPS （3-3-（胆酰氨丙基）二甲氨基丙磺酸内盐）、 Ampholine （PH 3-10 或 4-7 5-8）碘乙酰胺（Iodoacetamide, IAA）、EDTA-Na2（乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraaceticacid）、十二烷基磺酸钠（Sodium Dodecylsulphate， SDS）、溴酚蓝（Bromophenol Blue）、低熔点琼脂糖、
3、过硫酸 铵（Ammonium Persulfate APS）、TEMED （四甲基乙二胺）、丙烯酰胺、甲叉双丙 烯酰胺；Tris碱、甘氨酸、硝酸银、无水碳酸钠、无水乙酸钠、硫代硫酸钠、 甲醛、无水乙醇、冰醋酸、氢氧化钠、磷酸、甘油（丙三醇glycerin ）、牛血 清白蛋白（Bovine Serum Albumin， BSA）、蛋白质marker、蛋白定量试剂盒主要仪器DYCZ-26C、DYY-16D、DYY-6D、高速冷冻离心机、紫外分光光度计、0.1毫 克级电子分析天平、超声波细胞破碎仪、Millipore纯水仪（法国）、Eppendorf 普通离心机、beckman高速冷冻离心机、瞬时离
4、心机、恒温磁力搅拌器、UMAX 扫描仪（台湾）；恒温摇床、pH计、恒温振荡器等。本次试验材料：动物组织二.实验试剂的配制尿素8MCHAPS4%DTT65mM2%Ampholine(40%)溴酚蓝0.001% 10“样品裂解液4.805g0.4g0.098g （现加）每小管5毫克0.5 ml （现加）每小管25微升（1%溴酚蓝）MilliQ水定容至10ml，分装成20小管，每小管500uL, -20C冰箱保存样品覆盖液（含8 mol/L尿素，1% Ampholine）取4.8g新鲜尿素（超纯），0.3 ml Ampholine，用去离子水定容至10mL，分装，每管含有100L，置于-20C冰箱内
5、保存。胶条平衡缓冲液母液尿素6M36gSDS2%2gTris-HCl0.375M pH8.825ml（ 1.5M pH8.8 Tris-HCl）甘油20%20mlMilliQ水 定容至100ml分装成10管，每管10ml，-20C冰箱保存。 胶条平衡缓冲液I胶条平衡缓冲液母液10mlDTT0.2g充分混匀，用时现配。胶条平衡缓冲液II胶条平衡缓冲液母液10ml碘乙酰胺0.25g充分混匀，用时现配。低熔点琼脂糖封胶液低熔点琼脂糖0.5%0.5gTris25mM0.303g甘氨酸192mM1.44gSDS0.1%1ml（10% SDS）溴酚蓝0.001%1001（ 1%溴酚蓝）MilliQ水 定容
6、至100ml加热溶解至澄清，室温保存。第一向聚丙烯酰胺凝胶储液丙烯酰胺7.09g甲叉双丙烯酰胺0.405g25 mlMilliQ水溶解后定容至第二向30%聚丙烯酰胺贮液丙烯酰胺150g4gMilliQ水溶解后定容至500ml滤纸过滤后，棕色瓶4C冰箱保存。1.5mol/L Tris碱 pH8.8Tris 碱90.75gMilliQ水400ml用1mol/L HC1调pH至8.8，加MilliQ水定容至500ml。4C冰箱保存。10% SDSSDS10gMilliQ水100ml混匀后，室温保存。10% ApAp0.1gMilliQ水1ml （用时加水溶解）溶解后，4C冰箱保存。10X 电泳缓冲液
7、(1X= 25mM Tris，192mM glycine，0.1% SDS，pH8.3)Tris 碱30g甘氨酸144gSDS10gMilliQ水1L混匀后，室温保存。第一向电极液母液（用前稀释10倍）甲叉双丙烯酰胺正极电极液母液（0.1 mol/L磷酸）：取6.75mL磷酸用去离子水定容至lOOOmL。负极电极液母液（0.2 mol/L NaOH ）:取16.48gNaOH,用去离子水定容至 2000mL，置于4C冰箱内可以保存2周。注意：正负极缓冲液体系有多种，要分离不同PH范围的蛋白质，需要选择 恰当的缓冲液体系。3实验操作A. 第一向 IEF-PAGE1凝胶柱的玻管准备准备干净玻管（1
8、7cm X 2mm）内径1.5mm左右的，长度取18cm,先用2M 的NaOH 泡 至少1hr，用自来水冲后;用双蒸水冲，用双蒸水泡至少1hr,中间至少换2, 3次水;后用2M的HCL泡至少1个小时，用双蒸水冲，（不能用自来水冲），然 后双蒸水泡至少1个小时，中间换3，4次水，最后泡在无水乙醇里面1hr，轰 干。用Parafilm封口膜封好底部，在15cm处作好标记,待用。2配制等电聚焦凝胶柱的制备（环境温度25C）尿素（超级纯）5.5g第一向凝胶贮备液1.33 mlAmpholine0.5 ml去离子水1.97 mlCHAPS0.2-0.4gTEMED15卩110%AP50yl定容至10毫升
9、注意：在加入TEMED和10%AP之前，先减压抽气10min，加入后立即准备装管（TEMED和10%AP的用量，不同的实验条件，需实验室自行摸索，以 装管后2-4小时聚合为宜）3灌制第一向凝胶将干净的玻璃管置于盛有凝胶液的烧杯中（插入凝胶液面下），玻璃管一端 用封口膜或白色乳胶冒头密封住，用5mL针头从密封处插入，倒吸凝胶液于指 定位置（约15厘米处）后，室温下竖直放置，待凝胶聚合后，在凝胶表面加入 50卩1样品裂解液，再沿玻璃管内壁小心注入50卩1水。放置1-2小时后吸去凝胶 上层液体，再加入50卩1新鲜的样品裂解液，其上再覆盖0.02 mol/LNaOH电极缓 冲液。4预电泳下槽加0.01
10、 mol/L磷酸电极液，上槽加0.02 mol/LNaOH电极缓冲液。下槽 接正极，上槽接负极，打开电源，将电压分别调至200V、300V、400V分别15min、 30min、30min进行预电泳，以去除未聚合的单体和杂质。5加样和电泳（根据样品性质决定电泳时间，经验最重要）预电泳后，吸弃凝胶胶面的溶液，用微量注射器取样品液30p 1（约60-150ug 蛋白），沿壁加在浓缩胶面上，注入时要慢，避免有气泡，在样品液之上小心加 入样品覆盖液25p 1,再加入上极缓冲液充满覆盖液上方的空隙，将电压先恒定 400V-500V,电泳约16小时，再恒定电压1000V电泳约2小时。6.剥胶取下凝胶管，用
11、局麻针头注射器吸取一定量的蒸馏水，将针头插入胶柱-与 管壁之间，边注水边旋转玻管，直至胶柱与管壁分开，然后用洗耳球轻轻在玻管 的一端加压，使凝胶柱从玻管缓慢滑出，将凝胶柱置于编号的试管内，用蒸馏水 冲洗几次。B. 平衡取出胶条分别放入玻璃管中，用平衡缓冲液I在振荡仪上振荡15分钟，倒 掉平衡缓冲液I；再用平衡缓冲液II在振荡仪上振荡15分钟，倒掉平衡缓冲 液II,用去离子水冲洗2次（快速）。C. 第二向 SDS-PAGE1. 玻璃准备未用过的玻璃和使用过的粘有凝胶的玻璃都必须用3%的氢氧化钠溶液浸泡过夜才能使用，使用时先用水和清洁剂洗玻璃。用超纯水冲洗胶板，洗去清 洁剂，然后用无水乙醇擦洗胶板
12、。a、准备短玻璃胶板：1）带上新手套，用镜头纸少量蘸取剥离硅烷溶液擦洗玻璃板每个角落。2）5分钟后，用少量95%酒精浸湿镜头纸，在玻璃板上朝一个方向擦，然后 垂直方向擦，重复擦洗2次。b、准备长玻璃板：1）在准备长胶板前要换手套以避免交叉污染。2）用浸透12 ml硅化剂溶液的镜头纸擦洗玻璃板每个角落。3）在5分钟后，加2 ml 95%酒精在胶板上，用纸朝一个方向擦，然后垂直 方向擦，重复擦洗2次。注意：所有的清洗用具必须分开在短胶板和长胶板上使用，以免引起胶板的 交叉污染。如果已经交叉污染了，凝胶序列可能会破缝或变散。2. 凝胶配制及灌胶（1.0mm约80ml两块，1.5约130ml两块）在1
13、50ml烧杯中，配制100ml的12%的凝胶水33 ml第二向凝胶储备液40 ml1.5mol/L Tris碱 pH8.825 ml10%SDS1 ml10%AP0.5 mlTEMED0.02 ml在加入TEMED和10%AP之前，先减压抽气10min,加入后立即准备装管 （TEMED和10%AP的用量，不同的实验条件，需实验室自行摸索，4小时聚 合为宜）将玻璃板对齐，放置于制胶器中夹紧，防止胶液泄露，沿玻璃板上沿一侧缓 慢注入凝胶液，防止产生气泡，约2-3mi n灌好一块凝胶，在凝胶液表面加入约 700无水乙醇或正丁醇压胶，以防空气氧化，等待聚合。3. 胶条的放置待凝胶聚合后，将平衡好的IE
14、F胶条小心倒扣在硬塑料垫板上，由于胶条较 软、易碎，以格齿作以辅助，帮助胶条转移至第二向凝胶上（切忌胶条与凝胶接 合处不能有气泡）用配置好的低熔点琼脂糖（预先放置于微波炉中融化），密封 住胶条与空气接触表面，防止氧化。4电泳电泳条件：W恒功率，时间大约30min左右，然后4W恒定功率，大约30min, 最后调节至18W恒定功率，电泳4-6小时左右，当溴酚蓝到达胶底处即停止 电泳。5聚丙烯酰胺凝胶电泳的显色-银染一块胶的量：1. 固定：过夜+10min去离子水清洗X3冰醋酸：50ml无水乙醇200 ml定容至500 ml洗胶：把经固定的胶板置于盛有500 ml双蒸水的塑料盘中清洗三次，每次 10
15、min。2. 致敏：30min+10min去离子水清洗X3硫代硫酸钠：1.57g无水醋酸钠：34g无水乙醇：157.5 ml定容至500 ml洗胶：把经固定的胶板置于盛有500 ml双蒸水的塑料盘中清洗三次，每次 10min3. 染色：20min硝酸银：1.25g定容至500 ml银染20min后，纯水洗1minx2次（振荡混匀时，注意加遮蔽物以避光）。4. 显色：2-5min （可配置500X2瓶）碳酸钠：25g37%甲醛：0.2 ml定容至1000 ml1）先用少量显色液快速洗去“黄褐色泥沙样”的背景杂质；2）.再加入多量显色液，快速振荡，密切观察染色情况，尤其注意不可 染过，及时加入终止液。5. 终止显色：10min+30min清洗7.3g 的 EDTA.2H2O定容至 50
