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1、仪器分析分子排阻色谱法分子排阻色谱法是根据分子大小进行分离的一种液相色谱技术。分子排阻色 谱法的分离原理为凝胶色谱柱的分子筛机制。色谱柱多以亲水硅胶、凝胶或经修 饰凝胶如葡聚糖凝胶 Sephadex 和聚丙烯酰胺凝胶 Sepherose 等为填充剂，这些 填充剂表面分布着不同尺寸的孔径，药物分子进入色谱柱后，它们中的不同组分 按其大小进入相应的孔径内，大小大于所有孔径的分子不能进入填充剂颗粒内部 在色谱过程中不被保留，最早被流动相洗脱至柱外，表现为保留时间较短；大小 小于所有孔径的分子能自由进入填充剂表面的所有孔径，在柱子中滞留时间较长 表现为保留时间较长；其余分子则按分子大小依次被洗脱。1对
2、仪器的一般要求来源:考试大分子排阻色谱法所需的进样器和检测器同高效液相色谱法，液相色谱泵一般 分常压、中压和高压。在药物分析中尤其是分子量或分子量分布通常采用高效分 子排阻色谱法（HPSEC）。应选用与供试品分子大小相适应的色谱柱填充剂。使用 的流动相通常为水溶液或缓冲液，溶液的 pH 值不宜超出填充剂的耐受力，一般 pH值在2 8范围。流动相中可进入适量的有机溶剂，但不宜过浓，一般不应超 过30%,流速不宜过高，一般为0.5l.Oml/min.2系统适用性试验高效分子排阻色谱法的系统适用性试验中（1）色谱柱的理论板数（n）、（2） 分离度、（3）重复性、（4）拖尾因子的测定方法,在一般情况下
3、,同高效液相色 谱法项下方法,但在高分子杂质检查时,某些药物分子的单体与其二聚体不能达 到基线分离时,其分离度的计算公式为：除另有规定外,分离度应小于 2.0。3测定法（1）分子量测定法按各品种项下规定的方法,一般适用蛋白质多肽的分子量测定。选用与供试 品分子大小相适宜的色谱柱和适宜分子量范围的对照品,除另有规定外,对照品 与供试品均需使用二硫苏糖醇（DTT）和十二烷基硫酸钠（SDS）处理，以打开分 子内和分子间的二硫键,并使分子的构型与构象趋于一致,经处理的蛋白质和多 肽分子通常以线性形式分离，以对照品分子量（MW）的对数对相应的保留时间（tR） 制得标准曲线的线性回归方程logMW=a+b
4、tR,供试品以保留时间由标准曲线回归 方程计算其分子量或亚基的分子量。（2）生物大分子聚合物分子量与分子量分布的测定法生物大分子聚合物如多糖、多聚核苷酸和胶原蛋白等具有分子大小不均一的 特点，故生物大分子聚合物分子量与分子量分布是控制该类产品的关键指标。在 生物大分子聚合物分子量与分子量分布测定时，选用与供试品分子结构与性质相 同或相似的对照品十分重要。按各品种项下规定的方法，除另有规定外，同样采用分子量对照品和适宜的 GPC软件制得对照品重均分子量（MW）的对数对相应的保留时间（tR）制得标准 曲线的线性回归方程logMW=a+btR,供试品采用适宜的GPC软件处理结果，并按 下列公式计算出
5、供试品的分子量与分子量分布。Mn二工RIi/工（RIi/Mi）MW=Y（RIiMi）i/RID=MW/Mn式中Mn为数均分子量；MW 为重均分子量；D 为分布系数；RIi 为供试品在保留时间 i 时的峰高；Mi 为供试品在保留时间时的分子量。（3）高分子杂质测定法 高分子杂质系指药品中分子量大于药物分子的杂质,通常是药物在生产或贮 存过程中产生的高分子聚合物和生产过程中未除尽的可能产生过敏反应的高分 子物质。在正文品种规定的色谱条件下进行分离。定量方法 主成分自身对照法同高效液相色谱法项下规定。一般用于高分子杂质含量 较低的品种。 面积归一化法同高效液相色谱法项下规定。 限量法除另有规定外，规
6、定不得检出保留时间小于对照品保留时间的组分, 一般用于混合物中高分子物质的控制。 自身对照外标法一般用于SephadexG-10凝胶色谱系统中0-内酰胺抗生 素中高分子杂质的检查。在该分离系统中，除部分寡聚物外，0-内酰胺抗生素 中高分子杂质在色谱过程中均不保留,即所有的高分子杂质表现为单一的色谱峰 以药物自身为对照品,按外标法计算药品中高分子杂质的相对百分含量。附注SephadexG-10的处理方法。色谱柱的填装装柱前先将约15g葡聚糖凝胶SephadexG-10用水浸泡48小时, 使之充分溶胀,搅拌除去空气泡,徐徐倾入玻璃柱,一次性装满,然后用水将附 着玻璃管壁的 SephadexG-10 洗下,使色谱柱面平整,新填装的色谱柱要先用水 连续冲洗4一6小时，以排出柱中的气泡。样品的加入进样可以采用自动进样阀，也可以直接将样品加在床的表面（此 时，先将床表面的流动相吸干，将样品溶液沿着色谱管壁转圈缓缓加入，注意勿 使填充剂翻起，待之随着重力的作用渗入固定相后，再沿着色谱管壁转圈缓缓加 入35mL流动相，以洗下残留在色谱管壁的样品溶液）。
