生化绿色荧光蛋白的基因克隆及表达开题报告

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1、班级:姓名:学号:生物化学与生物分子学实验分子生物学设计性实验开题报告实验课题:绿色荧光蛋白的基因克隆及表达 指导老师：作者姓名:所在院系：小组编号：小组成员:完成时间：成都医学院Cheng Du Medical College题目：绿色荧光蛋白(GFP )基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达立题依据：随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展和广泛应用， 人们根 据自己的意愿有目的、有计划、有根据、有预见地将外源基因导入动 物细胞内, 使外源基因进行表达、阐明基因表达的调控机理或者通过 与染色体基因组进行稳定整合,将生物性状传递给子代动物的研究方兴 未艾1.1. 选材：大肠杆菌大肠杆菌是第一个用于

2、重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有 遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成 本低廉、可以快速大规模地生产目的蛋白等优点.而且其表达外源基因 产物的水平远高于其它基因表达系统,表达的目的蛋白量甚至能超过细 菌中蛋白量的30 ，因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系 统。2. 基因标记技术基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。荧光蛋白基 因在标记基因方面由于具有独特的优点而引起了科学家的广泛关注， 现已被普遍应用到分子生物学研究的各个方面。荧光蛋白是海洋生物 体内的一类发光蛋白,分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋 白和红色荧光蛋白2.3。绿色荧光蛋白从水母(

3、Aequorea vic toria)体内发现的发光蛋白。分子质量为 26kDa，由238个氨基酸构成，第6567位氨基酸(Ser-TyrGly)形 成发光团，是主要发光的位置。其发光团的形成不具物种专一性，发 出荧光稳定，且不需依赖任何辅因子或其他基质而发光.绿色荧光蛋白 基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的 报道基因.【实验目的】研究绿色荧光蛋白(Greed Fluorescent Protein, GFP)基因的基因 克隆及在大肠杆菌中的表达.【研究意义】研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达.通过质粒重 组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP,将重

4、组质粒导入大肠杆菌体 内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达 成功。根据电泳结果及荧光现象得出结论,重组质粒在大肠杆菌体内成 功诱导表达。GFP 的应用特点检测方便：不需要外加底物和辅助因子，用内眼就可以观察到， 在长紫外光照射下特别漂亮，以此作为标记，观察表达产物。实验题目包含的内容本实验的目的是通过BamH I和Not I两种限制性内切酶的消化把EGFP 基因从pEGFP-N3质粒中克隆出来，或者用PCR方法把EGFP基因从pEGFP N3质粒中扩增出来。并定向插入到表达载体pET28a质粒的多克隆位点 (MCS)中，用此重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)

5、,在IPTG的诱导下表达 出带有N端His-Tag的融合蛋白。表达了 GFP的菌体在离心管中则会呈黄绿 色,在紫外光激发下发射出特异的绿色荧光，从而证明了目的蛋白的表达是 否成功.另外在菌体总蛋白的SDS-PAGE电泳图谱中如果出现了明显的诱导条 带，则条带中蛋白浓度与诱导时间呈正相关。【根据现有的知识和技能来设计进行实验】1。查询两个质粒特点的资料: pEGFP-N3质粒编码野生型GFP的红移（荧光波长较大）变异体蛋 白，具有更强的荧光（在485nm激发下比野生型强35倍）和在哺 乳动物细胞中有较好的表达。激发峰在4 8 8 nm ，发射峰在 507nm。 pET-28a质粒载体上面携带一个

6、Nterminal His Tag/ Thrombin/T7 tag结构以及一个可以选择的Cterminal HisTag.克隆表达区域的编码框由T7RNA聚合酶转录。2。根据查询的资料,确定两种途径可以到达目标第一种方法：用限制性内切酶方法，如果选定内切酶的方式去做实 验，如何选择内切酶，选哪种内切酶即合用又经济。根据两个质粒结构的特点，要在多种内切酶中进行选择，考虑 pEGFP片段完整又考虑到被克隆的目标载体表达区域的编码框正确性。 使用Notl酶,Bamhl酶，这是一对最合适的内切酶。第二种方法：用PCR基因扩增方式达到目的.如果用PCR方法去做实验，必需根据pEGFP的序列设计引物。实

7、验原理】1。质粒重组：先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段，然后 体外使两者相连接，再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成.2. PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于 与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性一一退火一-延伸三个 基本反应步骤构成。合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链 重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制 链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板.每完成一个循环需24 分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。PCR技术是Kary Mullis在1985年建立起来的在细胞体外合成 DNA的一种方法.依D

8、NA半保留复制原理，利用DNA聚合酶依赖于DNA 模板的特性，在附加的两个引物与模板杂交之后，按碱基配对原则经 酶促反应合成DNA片段，包括模板变性、引物退火及用DNA聚合酶延伸 两个引物之间DNA的一定次数的重复循环，使包括在两个引物5端 限定的特异性片段形成指数式积累.整个过程操作简单,可在短时间内 在小管中获得大量的特意的DNA拷贝，这一特点使PCR技术很快被应 用到了分子生物研究的广大领域3.【参考文献】1 梁国栋。最新分子生物学实验技术 M . 北京: 科学技术 出版社, 2001, 174。2 贾艳华，李国勋，张杰 荧光蛋白及其应用3 魏春红，李毅主编聚合酶链反应PCR现代分子生物

9、学技术高等教育出版社，2006.7：45-46【研究方案】 通过分别将DH5a (pEGFP-N3)和DH5a (pET-28a)提取质粒、酶 切并连接形成重组质粒pET-28aGFP,将重组质粒导入E.coli DH- 5a感受态细胞中进行转化，通过限制性核酸内切酶Not I与Bam Hl和 PCR对所建质粒进行分析鉴定后，通过转化的方法把含绿色荧光蛋白(GFP)外源基因转入大肠杆菌体BL21内进行表达，再用IPTG诱导 GFP基因表达，根据观察是否可以看到显现绿色，判断GFP基因是否在 大肠杆菌中成功表达。【关键词】绿色荧光蛋白；质粒重组；原核表达；诱导表达【技术路线及实验方案】ET-28

10、a血粒/DH5讣悽PEGFP-N3 庾粒/DH5a |聊阳性克隆.提収质粒凹能克黑提取頂粒(悔切湖PCR扩增GFP片段fPCR法)Noth BamHl擁切.盹化 Noil. BamHl諭如 纯化1T4 DNA Ligase 连接阳性克隆扩增诱导表达SD&PAGE. Wesson Blwi畔 鉴世衷迹广趣【实验材料及试剂】注：最初始的两个质粒PEGFPN3质粒，pET28a质粒.1。实验材料克隆菌 E.coli DH-5a、表达菌 BL 21,质粒 pET28a 和 pEGFPN3，引 物，限制性内切酶Bam H1、Not I。2.实验试剂SIMf140 SANYO Eppendof 离心机 电

11、泳仪 电子天平台式离心机 控温磁力搅拌器 调温电热套 pH 计 冰箱 台式冷冻恒温振荡器 手提紫外灯 生物洁净工作台 琼脂糖凝胶电泳电泳装置 电热恒温水温箱 凝胶成像分析系统 酒精灯 培养皿 移液枪 枪头 接种环 酒精棉球 灭菌枪头 Parafilm 膜 离心管 IceMaker实验方法】 重组质粒的构建 DH-5a和BL-21 感受态细胞的制备 感受态细胞的转化 碱法提质粒 酶切鉴定 琼脂糖凝胶电泳 PCR聚合酶链式反应 Pet-28aGFP重组质粒转化到表达菌L21重组绿色荧光蛋白GFP的诱导表达具体实验步骤】1。重组质粒的构建重组质粒pET28a-GFP的构建流程2. DH-5a和BL-

12、21感受态细胞的制备1）将04 C保存的）H-a和BI21菌种分别接种在夜体培养基中37 C下250 r/m过夜培养 16 h。2）将分别接种过夜菌IB安1 : 50的比例接种于2 m的LB夜体培养基中37 C活化培养23至 OD=0.0.5 .3）取1。5 mL菌液转入iP管中，置于冰上0 min,然后于4 C下5000 r/m离心5 min弃上清液 沉淀加入0.1 m预冷的0.1 mol/L Ca缓和悬菌冰上放置1530 mi后，4 C下5000 r/m离 心 10 min4）弃上清液，沉淀用。1 m预冷的0。1 mol/L CaC含15%甘油）缓和悬菌，放在羽C冰箱 内保存。3。感受态细

13、胞的转化取制备好的感受态细胞00 “1，冰上解冻，均匀悬浮。2）加入2 “1酶连产物，轻轻混匀，冰上静置-30 min3）42C水浴中热击70 se后,冰上放置2 mi。4）加入200 “l L液体培养基37C，50T00 r振荡培养1 h。5）取200 “l悬浮细胞涂布在含合适抗生素的固体培养基上，用涂布器均匀涂布皿正放静置12 h后，封口膜封好平皿，37C培养倒置12-16 h4. 碱法提质粒1）感受态细胞经转化培养，后平皿内有但菌落长出。2）用灭菌吸头挑取单菌落，浸没于m含有抗生素的B夜体培养基中37C, 180 r/m振荡培养 过夜。3）取1.5 ml培养物倒入微量离心管中，用微量离心

14、机-C 11000 r/mi离心1分钝吸弃上清.4）向离心管中加入501用冰预冷的溶液I，用微量移液器吹打重悬沉淀5）加入200卩1新配制的溶液H，盖紧管口快速颠倒离心管次，冰上放置i分钟。6）加入150 pl用冰预冷的溶液皿，轻轻混匀冰上放置35分钟。7）用微量离心机于4C、11000 r/m离心5分钟，吸取上清转移到另一离心管。8）加等体积氯仿400pl抽提，振荡混匀，用微量离心机于C、11000 r离心2分钟，将上清转 移到另一离心管中。9）吸取上清液300pl，向上清中加入倍体积的无水乙醇混匀后，于室温放置分钟；用微量 离心机于4 C、11000 r离心5分钟，弃上清。10） 用70%

15、乙醇洗涤2次，再次4 C、11000 ri离心5分钟沉淀于空气中干燥。向已干燥的离 心管内力口20 pl超纯水溶解质粒NA加入2 pl 10 mg/ml R酶A，37C处理1小时后于-20C贮存5. 酶切鉴定1）取提取的质粒8 pl于另一微量离心管中，加入2 pl Bam H I和Not I的酶切混合液，轻 弹管外混匀反应物。2）离心，使溶液聚集在管底部3） 37 C，酶切反应。6. 琼脂糖凝胶电泳1) 称取0。8 g琼脂糖放入到锥形瓶中加入100mL 1xTA缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全融 化，冷却至60 C左右。2) 轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置3冷0却分钟以上。3) 将胶板除去封胶带，加电泳缓冲液至电泳槽中，加液量要使液面没过1胶1 。面5毫米，轻轻 拔除梳子。4) 吸取io m的质粒与2 m的上样液混匀，吸取混合液将加入加样孔5) 接通电泳槽与电泳仪的电源，设置电泳数据00 V 1=30 mA.6) 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前12 cn处，停止电泳。7) 在凝胶成像