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1、抗体工程制药（单克隆抗体）抗体是由成熟B细胞产生的。抗体的应用：研究：免疫荧光发检测特定抗原查验特定病原体医疗： 带有毒素的抗杀伤特定细胞。McAb在免疫导向疗法中存在的问题：A、McAb均是鼠源性抗体，可产生人抗鼠抗体（HAMA）,加速了排斥反映，在人体内的半衰期只有5-6h, 难以维持有效药物作用靶组织时刻；B、完整的抗体分子的相对分子质量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的医治浓度。 需要解决的问题：A、降低McAb的免疫源性；B、降低McAb的相对分子质量。基因工程包括以下内容 基因克隆技术将全套抗体H链和L链V区基因克隆出来，进行原核表达，挑选特异性的基因 噬菌体抗体库技术；含人
2、免疫球蛋白的转基因小鼠整体水平抗体生成技术细胞工程抗体生成技术基因工程抗体生成技术多克隆抗体（抗血清）（Polyclonal antibody给动物接种抗原所获得 的免疫血清或抗血清是多种抗 体的混合物，它是由多种抗原决 定簇刺激多株B细胞增殖分化所 产牛的，单克隆抗体（Monoclonal antibody, McAb）通过B细胞杂交瘤技术，获得特 异性针对某一种抗原决定簇的细胞克 隆，产生均一性的抗体特点:单一特异;可重复;大量供应、不需 纯抗原:灵敏度高嵌合抗体、改形抗体、“小型 化抗体”（单链抗体）、组合抗 体库技术、噬菌体抗体库技 术、Ig基因转基因小鼠、抗体 真核表达技术广州地域销
3、售抗体占全国的30%,第二是北京和上海（罗氏占绝对优势，鼠抗人CD3单抗是我国唯一品种）。 多克隆抗体：抗原注入一受体动物一产生多种B细胞一取得多种抗原（通过那个流程咱们能够得出多克隆 抗体的B细胞是不用和骨髓瘤细胞杂交的也自然不用挑选）制备单克隆抗体的大体原理：制备：抗原一受体动物一致敏B细胞+骨髓瘤细胞（PEG）杂交瘤（细胞培育（HAT培育基）一阳性挑 选一体内培育体外培育）一单克隆抗体；（杂交瘤细胞是为能再生成单抗，细胞活力高；这确实是什么 缘故书上说单克隆抗体的技术原理是基于动物细胞融合技术得以实现的）（1）抗原与动物免疫抗原：颗粒性抗原和可溶性抗原；不需纯化；化学合成或提纯；微生物或
4、细胞可直接作为抗原免疫动物：BALB/c小鼠和Lou大鼠；Balb/c小鼠，8-12周龄；雄性；动物与骨髓瘤同品系；佐剂:弗氏完 全佐剂与弗氏不完全佐剂免疫方式（Attetion:是免疫不是培育）：体内免疫:免疫原性强，抗原量多皮下，腹腔注射免疫。体外免疫: 不能用体内免疫的杂交瘤细胞株、不稳固初步免疫和增强免疫一测定抗体效价一处死小鼠，去脾细胞（2）细胞融合骨髓瘤细胞（次黄嘌吟鸟嘌吟磷酸核苷转移酶（HGPRT）缺点型）应和免疫动物属于同一品系，如此杂交 率高饲养细胞：在组织培育中，单个或少数分散的细胞不易生长繁衍，假设加入其他活细胞那么可增进这些 细胞生长繁衍，所加入的细胞称饲养细胞。经常使
5、用的有小鼠腹腔巨噬细胞、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。 用于细胞融和的骨髓瘤细胞应具有融和率高，自身不分泌抗体，所产生的杂交瘤细胞分泌抗体的能力强 且长期稳固等特点PEG浓度在10%-60%范围内的PEG都能使细胞发生融合。为了提高融合率，在PEG溶液中加入DMSO, 以提高细胞接触的紧密性，增加融合率。但必需严格限制接触时刻。（3）挑选与抗体查验附：HAT:次黄嘌呤（H），氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T）HGPRT :次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶胸腺嘧啶激酶（TK）次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）。如细胞含有此两种酶那么可启动补 救（应急）途径。次黄嘌呤,胸腺嘧啶在次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核
6、糖转移酶作用下合成DNA的合成，并可克服氨基蝶呤的 阻断.在HAT培育液中，骨髓瘤细胞缺乏TK或HGPRT而不能生长，而脾细胞能生长但不能长期增殖而死亡，只有杂交瘤细胞具有以上两种酶故能生长。脾细胞（HGPRT+, TK+,不能长期生长）；骨髓瘤细胞（HGPRT-,TK-，不能生长）；杂交瘤细胞（HGPRT+, TK+ ,能够生长）次黄嘌呤（H ）胸苷（T ）核酸补救合成一核酸一脾细胞（不能长期增值）/杂交瘤细胞一核酸一从头合成（甲氨蝶呤（A ）阻断）（4）杂交瘤的克隆化杂交瘤的克隆化指将抗体阳性孔进行克隆化。作用:分开抗体分泌细胞和非分泌细胞及其他抗体分泌细胞，非分泌细胞比分泌细胞生长快，可
7、抑制分泌 细胞的生长。方式：经常使用的是有限稀释法和软琼脂平板法。 有限稀释法：把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到96孔板，使每孔中在理论上只含有一个细胞。第一次克 隆化时也要应用HT培育液，以后的克隆化可用不含HT的RPMI 1640培育液。 软琼脂法：在培育液中加入的琼脂糖凝胶，细胞割裂后形成小球样团块，由于培育基是半固体状态， 可用吸管吸出，移入96孔板培育。单抗检测抗体查验：RIA、ELISA、免疫荧光技术等杂交瘤细胞的冻存；每次克隆后进行冻存（5）单克隆抗体的鉴定：特异性鉴定；类与亚类的鉴定（类:酶标或荧光素标记的IgG IgM）；中和活性的鉴定；识别抗原表位的鉴 定； 亲和力的鉴定；
8、效价鉴定杂交瘤细胞的染色体数量：接近两亲本细胞染色体数量的总和，在结构上多数为端着丝粒染色体外，还应 显现少数标志染色体。染色体数量多且较集中的杂交瘤细胞分泌高效价的抗体；反之，那么反。（6） 培育_ 体外培育法：可取得10g/ml的抗体。采纳RPMI1640，添加10%-20%牛血清。但由于培育液中含 有血清成份，给纯化带来困难。改良的方式有：无血清培育法、悬浮培育法、微载体悬浮培育法。无血清培育法：利用白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺等混合物代替小牛血清。此法虽可减少污染，但 产量不高。悬浮培育法：持续悬浮培育的细胞密度可达2*107/ml,搜集的单克隆抗体可达400 |ig/m 1。如在
9、培育液中加 入微载体，细胞密度可达108。 动物体内诱生法：可取得10mg/m1的抗体。大体程序：接种前1-2周，小鼠腹腔注射Pristane （降植烷）或用液体石蜡，然后注射1*106杂交瘤细胞， 7-12d便有腹水生成，待生成腹水后再提取，离心去细胞沉淀，取上清液冻存。优势：操作简便，比较经济，所得单克隆抗体量多且效价高，还可有效地保留杂交瘤细胞株和分离已 污染杂菌的杂交瘤细胞株。抗体工程制药（基因工程抗体）缺点：小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白，给纯化带来难度。第三节 基因工程抗体（Genetic engineering antibody）概念：采纳基因工程方式，在基因水平，对免疫球蛋
10、白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表 达，产生新型抗体。要紧包括嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双价抗体和双特异性抗体。目的：一是降低免疫源性；二是降低相对分子量，三增加组织通透性。一、单克隆抗体人源化（humanized antibody）；降低HAMA反映；人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区 与人抗体的恒定区融合而取得的抗体。单克隆抗体人源化嵌合抗体从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠 特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。人源化程度达到70%左右 杂交瘤细胞一mRNA分离一cD
11、NA （鼠VL人CL+鼠VH人CH；轻链只能和轻链编码一个区；两个载体共转染SP2/0 VH或VL基因.为避免人抗体的恒定区产牛不需要的副作用，可诵过点突变来修饰调整其效应。改型 抗体将小鼠的CDR （互补决定区）序列移植到人抗体可变区框架中，产生的抗体称为CDR移植抗体（通过PCR的方法 二代改型抗体：CDRs邻近处的序列在人源化方案中加以考虑；对鼠及人VH和VL表面引起强免疫原性的残基进 鼠抗同源性最大的人IG为框架，进行人源化设计：（1）模板替换：（2）表面重塑（3）补偿变换（4）定位保留。BUT亲和小分子抗体，Fab:单价 VH-CH1+VL-CL由两个片断由二硫键连接； 1/3;Fa
12、b与细菌的前导肽相连，入质周腔，装配折叠后，它具有结合抗原的活性。它具有与抗体 活性，其特点是结构稳定，制作简便（共转染）。Fab抗体易于穿透血管壁和组织屏障进入 减少了非特异反应和排斥反应：无ADCC和细胞毒CDC； 主要作为载体分子用于导向诊单 链 抗单价单链抗体（传统单链抗 体Fv:VH+VLFv:是由抗体重轻链可变区基因（VH、VL） 之间以非共价键结合;具有抗原结合能力 的最小抗体片段:故Fv不稳定连接肽的长度在10-15个氨基酸左右，不宜太 有柔软性，侧链少，抗原性弱等特点。（GGGGS）3。仅鼠源V区，为80 3体FV链酸 的 昔 定核 冗寡 稳当 键于能 锂ds用 硫FV.VL
13、Vbi接 FV澤樹 ddH 连 :也汐的 FVlilFV码 dssS编可附饗 酊合系临 锯工！适 克人潮到 也与潴装 在端177体 聚 氨t,导牛H2怕VH3小识别单位为一嫩甬曲 约由域力单 ，只弹诩嗓 VH它駕翳 o JJL- 上 为2 尺、保 y 11np /11了单 H 的中匕匕 聿)一厶厶冃 取呦功与 朗幽r洗 in谚只露 lr珑因暴 睦吨体H 衲幕FV 插鉴yL于 VL, V 由 或便独。 旷简单点 域构也其用 单体一有应 由抗专上能 别类和应才 分该力和造单链抗体最常用的表达体系是大肠杆菌，有2种方式：一是表达为包涵或非包涵体的不溶蛋白。产量高，可达细菌蛋白总量的5%-20%，但需
14、进行变性复性，使其形成正确的立体结构 二是分泌型表达，将细菌的信号肽序列与单链抗体的氨基端相连，单链抗体分子就可分泌到质周腔和细菌体外，进行折叠后成为 但产量不及前者，一般实验室培养条件下每升细菌的产量仅在数毫克左右。优点：无HAMA反应；能维持与抗原较高结合的性能；分子量小，穿透性强（单链抗体还可以穿过血管组织定位于肿瘤），体内 免疫原性低，易于穿透；但linker增加了新的抗原性或者会破坏ScFv的正确折叠。双价单链抗体分子（double-sFv）。dsFv在37C很稳定，具有很强的选择性杀伤细胞毒活性 适用：用于肿瘤的导向治疗:肿瘤的影像分布主要应用1 .放射免疫疗法2 .免疫毒素治疗3
15、 .体内解毒作用多 功 能 抗 体双特异 性抗体；BsAb要和小 分子抗 体分开多功能 抗体抗体融 合蛋白 要好好 看课件将两个抗体的重链和轻链V区基因的重组体导入宿主细胞中表达，或用肽链连接物连接两种不同特异性抗体的可 单肽双特异性抗体如：将抗肿瘤细胞EGFR的Fab与抗T细胞CD3的Fab组成双特异性抗体，有助于介导T纟 效-靶细胞）。此外还可作为载体将毒素、核酸、药物、定位于靶细胞，发挥治疗肿瘤和心血管疾病。与mAb相 下优点：（1）较低浓度即可杀伤或溶解肿瘤细胞；（2）对低表达或不表达肿瘤相关抗原的肿瘤细胞有杀伤或抑制作用 细胞毒性T淋巴细胞（CTL），发挥多种生物学效应，协助杀伤肿瘤细胞。能结合靶肿瘤细胞又能结合高细胞毒性 应细胞富集在肿瘤周围.而且可以模拟天然配体的作用.与细胞表面引发分子结合.激活效应细胞.实现对肿瘤细胞的scFv多聚体，包括二聚体，三聚体，四聚体等。克服scFv体内清除过快的不足。高亲和性，由于具有多个结合价 膜上相邻的多个靶抗原结合，有利干肿瘤的影像分布及治疗。同一细胞或相邻细胞膜表面受体发生交联，激活纟 抗体融合蛋白Antibody-cytokine fusion proteins :抗体恒定
