质粒DNA的提取、纯化和电泳检测

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1、质粒D的提取、纯化和电泳检测姓名 学号 同组人 班级 实验时间摘要:质粒是细菌细胞中与主染色体共存、可自主复制的一段大多数呈环形的DA，它是基因工程中一种非常重要的载体。质粒DNA的提取成为分子生物学实验室一项最基本的工作。碱变性提取法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的措施。电泳是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极移动的现象。凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA片段，是分子生物学的核心技术之一。本次实验运用碱变法对E.coli DH5受体菌中质粒U19的D进行提取、纯化和电泳检测,旨在学习并掌握质粒DN提取的原理、纯化及琼脂糖凝胶电泳技术。通过本次实验，我们达到了预期效果。核心词：质粒N

2、、碱变性提取法、质粒DA的纯化、DNA凝胶电泳1.引言质粒是细菌细胞中与主染色体共存、可自主复制的一段大多数呈环形的DNA。细菌质粒的相对分子质量大小从1kb至20b以上不等。某些质粒永远独立于染色体之外,此外某些质粒在一定条件下会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后裔。质粒在基因工程中质粒常被用做基因的载体。目前,已发既有质粒的细菌有几百种,已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状D分子（简称cccDNA）。由于质粒分子小、便于分离和提取的特点,在DN重组中，质粒或通过改造后的质粒可通过连接外源基因构成重组体,携带目的基因进入细菌、动物细胞或植物体内进行扩增与

3、体现,因此质粒是基因工程中一种非常重要的载体。质粒特性的分析已被广泛用于细菌种属鉴定、耐药性、毒力及同源性分析。近年来由于基因芯片技术的浮现,质粒基因探针的开发和应用也得到了飞速的发展，因此这就规定我们从宿主细胞中提取高质量的质粒DNA。因此，质粒DNA的提取成为分子生物学实验室一项最基本的工作。提取和纯化质粒DNA的措施诸多,目前常用的有:碱裂解/碱变性法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中，碱变性提取法最为典型和常用，是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的措施，是基于染色体DA与质粒DNA的变性与复性的差别而达到分离目的,合用于不同量质粒DA的提取

4、。该措施操作简朴,易于操作,一般实验室均可进行。提取的质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。碱变性提取质粒NA一般涉及三个基本环节：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DA。在细菌细胞中,染色体DN以双螺旋构造存在,质粒NA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染色体NA和质粒DN均被释放出来,但是两者变性与复性所依赖的溶p值不同。在p2的碱性条件下,染色体A的氢键断裂,双螺旋构造解开而变性;质粒NA的大部分氢键断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。当用pH值4.8的KAc(或NaA）高盐缓冲溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复本来的共价闭

5、合环状超螺旋构造而溶解于溶液中;但染色体A不能复性，而是与不稳定的大分子N、蛋白质-SD复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心,与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。溶于上清液的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液,使之凝聚而形成沉淀。由于A和RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同步,也随着着RN沉淀，可运用RNaseA将RNA降解。质粒DN溶液中的RaseA以及某些可溶性蛋白，可通过酚氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DA。电泳是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极移动的现象。多种生物大分子在一定H条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶是支持电泳介质，

6、它具有分子筛效应。具有电解液的凝胶在电场中,其中的电离子会发生移动,移动的速度可因带电离子的大小、形态及电荷量的不同而有差别。运用移动速度差别,就可以区别多种大小不同的分子。因而，凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化A片段，是分子生物学的核心技术之一。凝胶电泳技术操作简朴而迅速,辨别率高,辨别范畴极广。此外，凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如EB染色直接观测到,甚至含量少至20g的双链DNA在紫外激发下也能直接检测到。溴化乙锭(EB)是一种具扁平分子的核酸染料，可以插入到DA或A分子的碱基之间,并在3 nm波长的紫外光照射下放射出荧光,因此可用来显现凝胶中的核酸分子。在合适的染色条件下，荧

7、光的强度是同DN片段的大小（或数量）成正比。核酸在溶液中由于磷酸基而带负电荷,在电场中向正极移动。DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移速率重要取决于下面六个因素：(）样品DNA分子的大小:电泳时，线性双螺旋DNA分子是以头尾位向前迁移的，其迁移速度与分子量（所含碱基）的对数值成反比,这是由于大分子有更大的摩擦阻力。(2)DA分子的构象：分子量相似而构象不同的NA分子,其迁移速率不同。在抽提质粒DN过程中，由于多种因素的影响,使超螺旋的共价闭合环状构造的质粒DN（cccNA)的一条链断裂,变成开环DA（oDA）分子,如果两条链发生断裂,就转变为线状A(Line D)分子。这三种构型的分子有不同的迁移率

8、。一般状况下，超螺旋型（ccDNA)迁移速度最快,另一方面为线状分子,最慢的是开环状（cA)分子。(）琼脂糖浓度:琼脂糖浓度直接影响凝胶的孔径，一定大小的DN片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的泳动速度不同。一般凝胶浓度愈低，则凝胶孔径愈大,DA电泳迁移速度越快，即分子量越大，选用的凝胶浓度应越小。（4）电泳所用电场:低电压条件下,线性DA片段的迁移速率与所用电压成正比。电压愈高带电颗粒泳动愈快,但随着电场强度增长，高分子量DN的泳动速率以不同幅度增长，因此凝胶电泳分离DNA的有效范畴随着电压上升而减小，为了获得D片段的最佳分离效果,电场强度应不不小于5Vcm。(5）电泳缓冲液: 在进行分子电泳时所

9、使用的缓冲溶液，用以稳定体系酸碱度。常用的核酸电泳缓冲液有:TAE、TBE、TPE和OPS等。电泳缓冲液的作用：维持合适的pH。电泳时，正极发生氧化反映（OH-22O+O）,负极发生还原反映(H4e22)，长时间的电泳将使正极变酸,负极变碱。一种好的缓冲系统应有较强的缓冲能力,使溶液两极的pH保持基本不变;使溶液具有一定的导电性，以利于DNA分子的迁移，例如，一般电泳缓冲液中应具有0.00.4mol/L的Na+离子，Na+离子的浓度太低时电泳速度变慢;太高时就会导致过大的电流使胶发热甚至熔化；电泳缓冲液尚有一种组分是EDTA，加入浓度为12mM，目的是螯合Mg2+等离子，避免电泳时激活 D酶，

10、此外还可避免g2+离子与核酸生成沉淀。电泳缓冲液的构成和离子强度直接影响迁移率，当电泳液为无离子水(如不慎在凝胶中忘掉加缓冲液，即误用蒸馏水配备凝胶），溶液的导电性很少，带电颗粒泳动很慢，DNA几乎不移动;而在高离子强度下（如错用10电泳缓冲液)，导电性极高，带电颗粒泳动不久，产生大量的热,有时甚至熔化凝胶或使DNA变性。()温度:DNA在琼脂糖凝胶电泳中的行为受碱基构成和凝胶温度影响不明显。不同大小DNA片段的相对电泳迁移率在430内无变化，一般琼脂糖凝胶电泳多在室温下进行,而当琼脂糖含量少于0%时凝胶很脆弱,最佳在4下电泳以增长凝胶强度。2材料和措施2.1 材料和试剂实验材料：EciD受体

11、菌(生长在LB固体培养基)、有Am标记的质粒pUC1实验试剂：LB液体培养基、氨苄青霉素(Amp）母液（储存浓度1m/mL）、溶液、溶液、溶液、TE缓冲液、Tri饱和酚、氯仿异戊醇混合液、酚/氯仿/异戊醇（PC)(25：24：1）混合液、3Nc溶液、冰乙醇、7%乙醇、Rase 、灭菌双蒸水ddHO、50TA缓冲液、mg/mL溴化乙锭（EB）溶液、6上样缓冲液（6loadig buffe)、琼脂糖、Supercold DNA Ldder Mare、pU19、pUC19Hind实验仪器：接种环、三角瓶、天平、红盖瓶、酒精灯、恒温振荡培养箱、100mL离心管、1.5L塑料离心管、4离心机、涡旋振荡器

12、、微量移液器、不同型号枪头、制胶板、制胶槽、样品梳、电泳仪、紫外灯、微波炉、灭菌锅、恒温水浴锅、记号笔、盛冰的搪瓷杯、离心管架、手套2.2 措施2.21 E.oli5(p9）菌体培养（1）用Amp母液和B液体培养基配制L+Am(Amp工作浓度为10/m)液体培养基。(）用酒精灯灼烧且冷却后的接种环在LB固体培养基上挑取E.col D5单菌落，将接种环伸至+Am液体培养基中，在液体培养基与三角瓶瓶壁交界面处向液体培养基中接种E.coli D5(pUC19)。(3）将培养基在37、20rm下振荡培养过夜。（4）从过夜培养基中取%接种量接种到新的LB+Amp(Am工作浓度为100g/m）培养基,将新

13、的培养基在7、00rpm下振荡46小时，最后得到菌液。2. 碱裂解/变性法提取质粒DN(1)取出一支灭菌的00m离心管,标记上组号，用天平称量其重量，并记录为1。（2）向100mL离心管中倒入菌液至距瓶口1/处,每两组的两支1L离心管配平。（）将菌液在4离心机中6000rp离心5min，弃上清。(4）向菌液中加入5mL溶液,涡旋振荡，将菌液在4离心机中6000rp离心mi，弃上清。（)将0m离心管称重，标记其质量为2,计算W2-W1。(6)每100mg菌体量，加入(按菌体量接近的重新分组，溶液补平）：1.0mL溶液，充足涡旋振荡,用溶液再次配平；.0L溶液,轻柔颠倒混匀,冰浴35mn;1.5m

14、L溶液，轻柔颠倒混匀,冰浴5min。（7）将菌液在4离心机中rpm离心1mi,小心转移上清到新的离心管内，记录体积V。(）加入2V冰乙醇，颠倒混匀;-2静置15min。（9)将菌液在4离心机中m离心1mn，弃上清。(）加入mL0%乙醇,1rpm离心3mi,吸弃上清。（1）反复70乙醇洗涤一次,3风干51min。（1）分次加入1 T溶液并转移到EP管中，得质粒DNA粗提物。(13）向质粒DN粗提物中加入5Nae(10mgmL），终浓度为50g/mL，37孵育1小时。.3 质粒DNA的纯化将1L质粒DN粗提物分出500L到一新EP管中，使得每组两管。每个E管进行如下操作:()加入等体积的Trs饱和

15、酚，涡旋振荡，1rp离心mi；（2)转移上清（上清体积是V1）至新管,加入V1的酚氯仿异戊醇混合液，涡旋振荡，1m离心5m;（）转移上清(上清体积是V)至新管，加入V2的氯仿/异戊醇混合液,混匀,1r离心5in；(4)转移上清（上清体积是V3)至新管,加入/103的M aA溶液(pH=5.)，再加入2V4（V4=V3+10V3)的冰乙醇，混匀，2保存min;(5)1pm离心15min，弃上清;(6)加入0L 70%乙醇洗涤，1m离心2i,弃上清；(7)反复洗涤一次,吸弃上清，37风干5min；(8）每管加入2 TE溶解沉淀,合并，得50L纯化质粒NA。2.2.4琼脂糖凝胶电泳检测质粒NA（1）琼脂糖凝胶的制备。配制2LTA：取4mL 50A，用双蒸水将其稀释至2L。