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1、SSB亲和层析使用说明书一、简介噬菌体 T7 单链 DNA 结合蛋白（SSB, single-stranded DNA binding protein）由 696bp核苷酸编码，计算分子量为25.6kDa （SDS-PAGE凝胶电泳，该蛋白条带约 在27 kDa位置）。它与单链DNA有很强的亲和性，且无序列特异性。利用这一特 性，将SSB构建到不同宿主的表达载体中，可以实现在不同宿主中表达带有SSB 标签的融合蛋白，从而与偶联在介质中的单链DNA高效、特异性结合，这种结 合是可逆的，能够在温和、非变性的条件下通过改变洗脱液的pH值或盐浓度对 融合蛋白进行洗脱，达到纯化某一目标蛋白的目的。pSS
2、B系列载体用于构建可诱导、高水平表达的基因或基因片段，表达的融 合蛋白的N端或C端带有SSB标签。SSB标签可根据需要由位点特异的蛋白酶切 除，pSSB系列质粒上多克隆位点上游包含有肠激酶（enterokinase）、凝血酶、TEV 等识别序列。带有标签的蛋白可以通过免疫学方法进行检测，同时根据实验需要 决定是否切除标签。SSB亲和层析介质（经过特殊处理的ssDNA-cellulose）是专门设计用于纯化 SSB融合蛋白及与目的蛋白有亲和作用的蛋白复合体的分离介质，通过盐离子梯 度洗脱可得到高纯度的SSB融合蛋白。纯化条件温和，不引入其他物质，能够保 证蛋白的活性。二、pSSB载体现有的pSS
3、B载体系列按宿主不同可以分为以下四类：1）大肠杆菌类;2）酵 母类;3）人细胞类；4）昆虫细胞类。每一个类别中均含有带有N端和C端的SSB 标签质粒，每个质粒都含有相应的蛋白酶切位点，可以根据实验需要，将SSB标 签从融合蛋白中切去。在不同的宿主载体中，它们的启动子也各不相同，通过各 自的启动子实现严格调控插入片段的表达。相关参数如下页表一所示：表一：pSSB系列载体宿主载体SSB位于目的蛋白 的N端或CAm端抗性启动子蛋白酶切 位点是否带His标签大肠杆菌 E.colipSSB-EIN端卡纳抗性T7肠激酶否PSSB-E2N端卡纳抗性T7肠激酶是PSSB-E3N端(SSBJ 26C)标签)卡纳
4、抗性T7肠激酶是PSSB-E4N端卡纳抗性T7凝血酶是PSSB-E5N端卡纳抗性T7凝血酶否PSSB-E6C端卡纳抗性T7肠激酶是酵母YeastpSSB-YIN端卡纳抗性nmtl肠激酶是PSSB-Y2N端氨苄抗性nmtl肠激酶是PSSB-Y3C端氨苄抗性nmtl肠激酶是人细胞HumanPSSB-H1N端氨苄抗性CMVTEV是PSSB-H2C端氨苄抗性CMV肠激酶是昆虫细胞InsectPSSB-I1N端氨苄抗性PH肠激酶是PSSB-I2C端氨苄抗性PH肠激酶是具体信息详见网站：。三、插入基因片段每一个pSSB表达载体设计有多个克隆位点。根据需要，DNA片段可被插入 到某一特定的位点。四、优化表达
5、插入DNA片段的方向和载体的连接确定无误后，下一步将要优化带SSB标 签融合蛋白的表达，确定了最佳的蛋白表达水平及相应的生长条件后就可以进行 大规模的培养。生长条件应考虑最佳的蛋白表达水平，确定一系列诸如培养基、生长温度、 密度、诱导条件等参数。保证足够的通气条件、缩短各个生长时期的时间以及使 用正确的抗生素进行筛选都是非常重要的。同时应当确定表达的融合蛋白是在包 涵体状态或可溶状态。SSB在一定程度上可以促进目的蛋白的溶解，但有时候会因为过度表达而导致蛋白不能以正确的方式折叠，从而形成包涵体。为降低包涵 体的形成，可以适当调整培养基条件来提高重组蛋白的溶解能力，女如生长温度 降低至15-30
6、 r，增加通气，改变诱导条件如降低蛋白表达的速率等。五、ssDNA-cellulosessDNA-cellulose由单链DNA (ssDNA)与处理过的cellulose进行偶联所得， 大约1g cellulose可以偶联2-3mg的ssDNA。ssDNA可以与SSB特异性结合，且 1ml溶胀好的ssDNA-cellulose柱料可以结合1-2mg的带有SSB标签的融合蛋白。 此介质是自主设计合成的，具有优良的物理和化学稳定性，操作方便，批次重复 性好，是研发的理想选择，具体性能参数如表二所示：表二：ssDNA-cellulose的性能参数特点成本低，操作方便基质纤维素吸附载量1ml吸附1-
7、2mg的SSB融合蛋白介质平均直径100 MmpH范围3-10保存温度4-8 C保存条件干燥保存六、纯化SSB标签蛋白可以通过亲和层析柱(ssDNA-cellulose)比较方便的从细胞裂 解物中纯化。纯化时，标签蛋白与配体结合，杂质通过结合缓冲液被洗脱去除， 之后标签蛋白在温和、非变性的条件下被洗脱下来，可以使蛋白的抗原性能和功 能得以保护。如果需要将SSB标签从目的蛋白上切除，标签蛋白可以在与ssDNA-cellulose 结合时使用合适的位点特异性蛋白酶酶切，也可在洗脱之后再酶切，在标签蛋白 与介质结合时酶切可以节省分离SSB标签与目的蛋白的步骤，因为这样在洗脱目的蛋白时SSB标签仍旧结
8、合在介质上。七、操作说明1）缓冲液配制：TE： 10mM Tris-HCI （pH=8.0）, 1mM EDTA;结合缓冲液：50 mM Tris-HCI （pH=8.0）, 100 mM NaCI 或 100 mM KCI, 5 mM EDTA, 2 mM DTT, 10% glycerol。（结合缓冲液的盐浓度可以根据要纯化的蛋白性质来调节）2）操作步骤：1、 取适量ssDNA-cellulose干料，用TE缓冲液溶胀约2-4个小时。0.2g干料可 溶胀为1ml柱材料。装入层析柱后，用5-10倍的柱体积的TE（pH=8.0）洗涤柱 子，将未偶联的多余DNA去除。2、用结合缓冲液平衡柱子5-
9、10个床体积。3、用上述结合缓冲液溶解表达的带有SSB标签融合蛋白的细胞，然后将其超声 破碎或者裂解破碎，细胞裂解液高速离心后取其上清，缓慢注入层析柱，如果样 品挂柱效率低，可降低流速及重复上样。上样完毕后用平衡缓冲液再洗至基线。4、用5-10个柱床体积的低盐（0.1 M NaCI或KC1）缓冲液洗脱杂蛋白。5、然后，梯度性地提高盐浓度，洗脱目的蛋白。3）柱子再生：如果连续重复纯化同一个蛋白，柱子可以再生：首先用含有1.5M或2M的 高盐缓冲液清洗柱子5-10个柱床体积，然后用大量蒸馏水清洗，最后用结合缓 冲液重新平衡。如果长时间不用或者是纯化其它蛋白，建议重新使用新的柱材料 进行纯化。4）注
10、意事项：结合缓冲液可以随自己所需的要求进行适当更换，如可以使用PBS等其它 buffer，但需注意的是，最好不要加入Mg2+，EDTA的浓度保持在2-5mM左右。层析柱在纯化之前溶胀，时间2-4小时，由于DNA与cellulose是物理偶联， 所以不建议长时间溶胀后使用，重复使用次数不要超过三次。八、应用举例实例1：将Sap1蛋白的基因重组于质粒PSSB-E4中，并对表达的融合蛋白 SSB-Sap1进行纯化。在E.coli中表达的SSB融合蛋白，每升细胞培养物可以得到3至30毫克蛋 白。不同的目的蛋白，表达起伏较大。下面详细介绍用ssDNA-cellulose纯化融 合蛋白SSB-Sapl并用
11、凝血酶对标签蛋白进行切割。Sapl在裂殖酵母中大量存在，分子量为30kDa。通过PCR反应从裂殖酵母 基因组DNA中扩增得到Sap1基因的DNA片段,插入到pSSB-E4载体的Bam HI 和Hind III位点。通过筛选获得的编码融合蛋白6His-SSB-Sap1的重组质粒转化 到E.coli BL21 (DE3)pLysS细胞中，次日，挑取单菌落接到50ml含有50mg/m卡 那霉素LB培养基中培养过夜。过夜的菌液以1:100的比例接到新鲜的培养基中， 在37C培养至OD60为0.5左右，加IPTG到0.1mM的终浓度，继续37C培养 诱导3.5h,然后离心收集细胞，用含有0.4M NaC
12、l的结合缓冲液(50 mM Tris-HCl (pH=8.0), 5 mM EDTA, 2 mM DTT, 10% glycerol)悬浮菌体，超声破碎细胞， 37000g离心30分钟。全细胞提取物，以及随后的细胞裂解液的沉淀和上清用 SDS-PAGE检测，图一表明：6His-SSB-Sap1融合蛋白可溶性高，离心后约90% 以上在上清中。由于Sap1蛋白对盐浓度较为敏感，所以我们选择先高盐得到可 溶性蛋白后，将其稀释到100mM的盐浓度，高速离心后取上清再对其进行层析 纯化。Null Control层析柱先用TE清洗5-10个柱床体积以去除未偶联的DNA,后用结合缓1.冲液平衡5-10个柱床
13、体积。2. 用注射器或蠕动泵加入已处理好的样品，为了获得最好的结果，上样时可以调低流速或者重复上样。3. 用结合缓冲液至少洗涤5-10个柱床体积，直到吸收达到平稳的基线或在 流出物中没有物质流出。4. 低盐缓冲液 50 mM Tris-HCl (pH=8.0)，0.2M NaCl，5 mM EDTA, 2 mM DTT, 10% glycerol洗涤柱子3-4个柱床体积以进一步去除非特异性结合 的杂蛋白。5. 用高盐缓冲液 50 mM Tris-HCl (pH=8.0)，0.4M NaCl，5 mM EDTA, 2 mM DTT, 10% glycerol洗脱目的蛋白，分管收集。纯化结果如图二
14、所示，根据密度测定法，6His-SSB-Sap1的纯度可达到96% 左右。MW(kDa)11666.245,035.0-25.0-Figure2:The purification of6His-SSB-Sapl in E.colCell extract with ssDNA-cellulose affinity chromatography.取 100g6His-SSB-Sap1 加入 1 单位的凝血酶在 0.1M NaCl, 2.5M CaCl2, 50 mM Tris-HCl (pH=8.0), 5 mM EDTA, 2 mM DTT, 10% glycerol 中室温温育 2 到5个小时
15、，如图三所示，6His-SSB-Sap1融合蛋白被凝血酶充分酶解，6His-SSB可以进一步通过镍-琼脂糖层析除去。WIW(kDa)11666 2-4弓d35.0-25.0-Figure3: Removal of 6His-SSB tag by Ni2七NTA Agarose column after thrombin digestio n.实例2：将cdsl基因重组入质粒pSSB-Y2中，并对表达的融合蛋白SSB-Cds1 进行纯化在酵母中表达的蛋白，一般表达量都很少，目的蛋白占总蛋白的量比例在1%左右甚至更低，只有用western-bloting才能检测出来，但是，酵母中表达的 蛋白质一般不会形成包涵体，所以也是蛋白表达较好的一种宿主菌株。Cdsl基因全长1383bp，编码460aa，是一个DNA复制过程中细胞周期检验 点中关键的蛋白激酶。将cd
